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T SPOT TB技术用于辅助诊断结核临床病例报道 莫凌，孟成艳，张舒，金嘉琳，张文宏 作者单位：200040 上海，复旦大学附属华山医院感染科 通讯作者：张文宏，Email：zhangwenhong@fudan.edu.cn 退修稿：0074 基金项目：国家重点基础研究发展计划（2005CB523102） 近年来，我国结核病的发病率有上升趋势，临床上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核病，而目前可用于诊断结核病的方法有限，同时又缺乏快速敏感的实验室技术，为结核病的早期诊断与治疗带来困难。ELISPOT（enzyme-linked immunospot assay, 酶联免疫斑点法）技术是一种新型的免疫酶技术，它是从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细胞因子细胞[1]。由ELISPOT发展来的T SPOT TB（结核感染T细胞斑点试验）技术就是通过检测结核感染后T淋巴细胞分泌的特异性的细胞因子IFN-γ来诊断是否存在结核感染。 1．ELISPOT技术原理 该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段存在结核分枝杆菌中名为“RD1”的基因序列[2]，而在卡介苗菌株和大部分环境中的分枝杆菌基因中则缺乏RD1序列。RD1编码产生两种蛋白：ESAT-6和CFP-10（culture filtrate protein），ESAT-6和CFP-10作为特异性抗原刺激机体T淋巴细胞产生特异性的细胞因子IFN-γ。 根据这一原理，T SPOT技术利用结核杆菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的活化T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌γ干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。外周血单核细胞，结核特异的混合抗原A和混合抗原B（分别为ESAT-6和CFP-10的部分多肽片断），对照试剂一起加入预先包被抗γ干扰素抗体的微孔培养板进行培养。当外周血单核细胞中存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞时，培养液中加入的结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激这些效应T淋巴细胞分泌γ干扰素。分泌的γ干扰素被微孔板上的抗体捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记并针对γ干扰素不同表位的抗体与被捕获的γ干扰素结合，滞留在微孔板表面。显色底物溶液在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每一个斑点代表一个γ干扰素分泌细胞（结核特异的效应T细胞）。通过对斑点进行计数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而对结核杆菌感染进行辅助诊断。 2．ELISPOT操作方法 采集8ml患者的血液加入含柠檬酸钠的CPT采血管，分离外周血单个核细胞（PBMC），加入细胞培养液，轻轻重悬细胞。在已包被抗IFN-γ抗体的微量板的4个孔中，分别加入细胞培养液作为阴性对照，植物血凝素PHA作为阳性对照，结核分枝杆菌特异混合多肽A和B，分别含ESAT-6与CFP-10（Oxford Immunote Ltd., Oxford, UK）。然后在每个孔中加入含250000个细胞的上述悬液。把微量板放在37℃培养16-20小时后，用PBS液洗板4次，加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗人IFN-γ单抗，在2-8℃下孵育1小时。孵育后再用PBS液洗板4次。最后每孔加入显色底物液BCIP/NBTPLUS，室温中静置7分钟后观察结果，并用计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计（ELISPOT试剂盒由上海复星科技有限公司提供）。第一孔为阴性对照孔，第二孔为阳性对照孔，如出现斑点，说明试验成功。第三，四孔为实验孔，当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：（1） 如果阴性对照孔斑点数为0-5个，测试孔斑点数减去阴性对照孔斑点数≥6。（2） 如果阴性对照孔斑点数≥6个，测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。 3．ELISPOT的临床应用 我院传染科首次将T SPOT TB技术用于临床，辅助诊断疑似结核患者，为结核病的诊断提供了一项新的技术，并取得一定成效。现将一例经T SPOT TB 技术鉴别诊断后得到有效治疗反应的病例报道如下。 3．1．病例报道 患者，男，62岁。入院前3月无诱因下出现颈部疼痛,一月前出现左上肢麻木,进行性乏力，伴发热，体温在38度左右，无畏寒，寒战，无咳嗽，咳痰，无消瘦，盗汗等。入院查体，精神较萎，左侧颈部可扪及肿大淋巴结，质软，无压痛。心肺无特殊，腹软，肝脾肋下未及。颈软，克氏征（-），布氏征（-），余病理征均阴性。左上肢肌力3级，肌张力可，余肢体肌力，肌张力正常。 辅助检查，血常规：白细胞9.42×109/L,中性粒细胞72%。脑脊液：白细胞 2×106/L，总蛋白 983mg/L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物 120mmol/L。脑脊液抗酸染色，细菌涂片培养，真菌涂片培养均阴性。颈椎MRI：多发椎体异常信号伴硬膜增厚（图1）。头颅MRI示：双侧额叶、侧脑室旁多发斑点