微生物与免疫学04 实验四 酶联免疫吸附实验 ELISAPPT.pptVIP

实验五 酶联免疫吸附实验 免疫酶技术 免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原）联结，与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量，亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。 目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。 ELISA简介 1971年瑞典学者 Engvall 和Perlmann，荷兰学者Van Weeman和 Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA） ELISA基本的实验过程 包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化 抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定 酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色 ELISA检测抗原 Ag + Ab* Ag-Ab* ELISA检测抗体 Ab + Ag* Ab-Ag* 由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。 间接法比直接法灵敏 酶标板 酶标仪 一 、ELISA法间接法检测血清中HBsAb 【实验目的】 　　1．熟悉ELISA的原理。 　　2．了解免疫标记技术的原理。 【实验原理】 　　采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP。 当标本中存在HBsAb时，就会形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺 )底物产生显色反应，反之就无显色反应。 将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成） 将待测血清加入，温育，血清中如有HBsAb，则抗原抗体结合 加入酶复合物， (HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合 加入酶的底物，酶与底物反应，显色 二、ELISA间接法检测血清中HBsAg 原理同检测抗体,但小孔底部包被的为HBsAb 酶复合物为:HBsAb-HRP 当标本中存在HBsAg时，就会形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺 )底物产生显色反应，反之就无显色反应。 【实验材料】 　　1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶联免疫诊断试剂盒。 　　预包被微孔条（用纯化的单抗-HBs或纯化HBsAg包被） 　　酶结合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP ） 　　阳性对照 　　阴性对照 　　洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍) 　　显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H2O2 ） 　　终止液（2 mol/L H2SO4）。 　　2．微量加样器，吸水纸等。 ①检测HBsAg或HBsAb的反应条 ② 酶标抗体 ③阴性对照血清 ④阳性对照血清 ⑤洗涤液 ⑥显色液(A,B) ELISA试剂盒包含以下各组分： 待测血清1号、2号、3号、4号 注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。 实验步骤 每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的反应条各一条, 每条含6个反应孔。 每组有2种试剂盒(黄色测HBsAg,粉红色测HBsAb),黄色试剂盒用黄色反应条,粉红色试剂盒用红色反应条。 3、 检测方法 每孔加待检血清50ul, 每次实验各做1个阴性对照和阳性对照;本实验空白对照孔不设，前面讲台上有空白的反应条，可以作为空白对照。 注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。 阴性 阳性 待检血清甲,乙,丙…………. 对照 对照 1号同学取待测血清1号 ………….. 阴性 阳性 待检血清甲,乙,丙…………. 对照 对照 1号同学取待测血清1号 2号同学取待测血清2号 ………….. 2号同学取待测血清2号 (2)每孔加1滴酶结合物 , 充分混匀，37℃孵育30min (3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）； (4)每孔加满洗涤液,静置1min, 甩干。 同上洗涤重复5次，拍干。 (6)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min.按以下方法,进行肉眼观察结果: 阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色; 待测孔显蓝色, 为阳性,否则为阴性