[农学]核酸提取和注意事项.ppt

学 习 汇 报 核酸提取的原理及方法 汇报人:富贵 青海大学2010级研究生 前言 核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此，核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。 核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳 核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′- 磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两类。 DNA主要储存遗传信息。 RNA主要传递遗传信息。 核酸简介 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200 kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。 质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌等细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。 核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 基因组DNA提取的几种常用方法： CTAB法 SDS法 其他方法 基因组DNA提取——CTAB法 CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 基因组DNA提取——CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方 基因组DNA提取——CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方 基因组DNA提取——CTAB法 CTAB法实验流程 基因组DNA提取——SDS法 SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法适用于大部分实验材料基因组DNA提取。如动物组织、细胞、全血、细菌、酵母等。 基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测 琼脂糖凝胶电泳： 以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 基因组DNA提取常见问题 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA降解 DNA量少 基因组DNA提取常见问题分析 DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类物质 ——抽提纯化、高盐洗涤 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 ——重新沉淀 DNA中残留有金属离子 ——重新70%乙醇漂洗 基因组DNA提取常见问题分析 DNA降解 材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 基因组DNA提取常见问题分析 DNA提取量少 实验材料不佳或量少 —— 选取新鲜（幼嫩）材料 破壁或裂解不充分 ——充分研磨、破壁酶、延长裂解时间 沉淀不完全 ——低温、延长沉淀时间 洗涤使得丢失DNA 核酸简介 基因组DNA提取 质粒DNA提取 真核细胞总RNA提取 琼脂糖凝胶电泳 质粒DNA提取 质粒DNA提取的方法： 碱裂解法 煮沸法 质粒DNA提取——碱裂解法原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒工作原理 离心柱型质粒DNA提取试剂盒采用改进的 SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 质粒DNA提取及检测——实验准备 1.实验器材 台式高速离心机、旋涡混合仪、移液器、定时器、 marker笔、 电子天平、电泳设备、凝胶成像系统、微波炉、量筒、试剂瓶、锥形瓶等。 2.实验耗材 无菌2 mL/1.5 mL EP管、各规格Tip、一次性手套等。 3.实验试剂 质粒小提试剂盒（离心柱型，YRBIO) 、LB培养基、抗生素、 琼脂糖、DNA Loading Buffer、 GoldView核酸染料、 TAE电泳缓冲液等。 4.实验材料 对数期菌株