[医学]RNAi-201111-2009生物科学.ppt

Genomics: What’s Next? Post-transcriptional Control: RNAi的发现 1995年，Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释不相符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。 Discovery of RNAi RNAi的提出 直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）。 Brief History of RNAi Discoveries 1、RNAi 机制 RNA 干扰相关的主要蛋白因子 Dicer 是RNAi 机制中的关键因子，在起始阶段产生RNAi 标志性组分siRNA 和另一种调控基因表达的非编码小RNA-microRNA ( miRNA) 。Dicer 属于RNaseⅢ家族成员，在进化上高度保守，是一种ATP 依赖性核酸内切酶。各物种的Dicer 都具有相似的结构域，其中Dicer 的N 端是1 个RNA 解旋酶结构域，随后是1 个PAZ 结构域，在C 末端是2 个RNaseⅢ结构域和1 个双链RNA 结合结构域( Double-stranded RNA bindingdomain，dsRBD) 。 RNAi研究的一般技术路线 2、siRNA 的设计 何为siRNAs 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。 如何设计有效的siRNA一直是当前RNAi研究的热点话题，不同的实验室有不同的结果。 Key components for successful SiRNA SiRNA design:specificity with high efficiency (Bioinformatics tools), SiRNA only hits the targets efficiently but not off-targets. Production of high-quality SiRNA（purity at least 90%) Delivery to the target cells (in vitro) or organ (in vivo). 一般设计原则 Scan mRNA for AA dinucleotide sequences. Record the occurrence of each AA and the 3’ adjacent 19 nucleotides. G/C content 50% is preferable. BLAST search candidates, eliminating those with significant homology to other coding sequences. What else…… 负对照 一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。 3、制备siRNAs的方法 Methods for producing SiRNA Direct synthesis of siRNAs Chemical synthesis of RNA nucleotides In vitro transcription of short RNAs or long RNAs followed by Rnase cleavage Vector-based expression of shRNAs Plasmids Viral vectors （1）化学合成 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可以根据用户要求提供高质量的化