[医药卫生]05基因文库12.pptVIP

生物技术专业核心课程 基因工程过程示意图 第十二章 基因文库GENE LIBRARY 基因文库是指包含了一个生物细胞中全部DNA序列的片段与载体连接构成重组DNA分子经转化宿主细胞后所形成的克隆群体。 应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomic library。 基因文库分两类： 基因组文库（genome DNA library）G-库 cDNA文库（cDNA library）C-库 基因库 gene pool / gene bank 特定生物体全基因组的集合（天然存在） 第一节 基因组文库 一、基因组文库的概念和应用 指一种生物全部基因组序列的随机DNA片段的重组DNA克隆的群体。每个克隆含有一段DNA序列，足够数量的克隆群体的总和就构成基因组文库。 以DNA片段的形式存储某种生物的基因组全部DNA序列信息，可以用来选取任何一段感兴趣的序列进行复制和研究。 二、基因组文库的完整性与代表性 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？ 其计算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N ? 基因文库所包含克隆的数目； p ? 任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%； f ? 克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。 三、构建基因组文库的载体系统 根据插入DNA片段的大小，来选择载体。 按功能载体分： 克隆载体 (cloning vector) 表达载体 (expression vector) 粘粒载体 cosmid 粘粒（柯斯质粒）实际是质粒的衍生物： 带有将DNA包装到?噬菌体颗粒中所需的 cos序列； 质粒复制起点（colE1）,抗性标记ampr cos位点，能象质粒一样转化, 增殖 。 可克隆38～47kb外源片段 四、基因组文库的构建 克隆原理及基本步骤 1．通过细菌培养增殖载体 回收、纯化载体 2．基因组DNA的制备 3．连接：分别酶切载体与外源DNA ，再连接 4．包装 ?溶原菌株(BHB2688+BHB2690) 5．感染宿主细胞/铺平板 6．筛选某个DNA片段： 嗜菌斑原位杂交 噬菌体为载体的基因文库的构建 第二节 cDNA文库 一、基本概念 cDNA文库是指某一组织中全部的mRNA反转录为cDNA而构建的克隆群体。即某一组织细胞中全部表达的蛋白质的基因文库。 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同）。 三、cDNA文库构建 （一）mRNA的分离纯化 mRNA分离策略是基于真核细胞的mRNA含poly A尾。 用oligo dT从总RNA分离出mRNA。 总RNA的提取关键是防止RNA酶对RNA的降解。 （三）cDNAs与载体的连接和克隆及筛选 λgt系列等质粒载体 嗜菌体载体 酵母双杂交载体 多选用表达载体 表面展示载体 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 A B C D E F G 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 01 04 12 06 13 14 02 14 07 19 11 15 05 08 16 03 10 09 20 18 D A B C E F G 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 F C A D G E B 基因组文库重组克隆的排序 从基因文库中任取一个克隆作为染色体走读的起点，将之两端序列分别亚克隆，亚克隆片段在0.5 - 2.0 kb范围内 分别以上述亚克隆DNA片段为探针，杂交同一基因文库，杂交阳性克隆中的插入DNA片段必定与起点克隆所含的DNA片段连锁在一起 然后再以阳性克隆片段的两端序列为探针，进行第二步走读，直至线型染色体DNA的端点 染色体走读法（chromosome walking） 染色体走读法（chromosome walking） 走读的起点克隆片段 亚克隆旁测序列 探针标记 第一轮杂交 阳性克隆 阳性克隆 第二轮杂交 第