[医药卫生]细胞培养技术.pptVIP

细胞培养基本技术 一、培养细胞简介 1907年Harrison；1912年,Carrel 优点：研究对象是活细胞；研究条件可人为控制；研究样本具有均一性；研究内容便于观察、检测、记录；研究范围广泛；研究费用相对经济。 缺点：体内外差异；不稳定性；人员、设备 1.基本概念 细胞培养：泛指体外培养，指从动物活体体内取出组织，并模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行孵育培养，使之生存并繁殖。 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米置于底物上孵育，细胞自其周围移出并增殖。 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 2.培养细胞的特性 按生长方式分： 贴附生长型：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长型：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 1.单个细胞的增殖过程： 细胞周期： 指细胞一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程。 各期的主要活动 （1）合成前期（G1期） 物质准备阶段。细胞周期的长短主要取决于G1期的长短。不同细胞G1期长短悬殊较大。4－5h或数日 （2）合成期（S期） DNA的复制，含量加倍；组蛋白的含量也相应增加。 细胞周期的关键时刻，时间差别小，2－30h之间，平均6－8h。 （3）合成后期（G2期） 合成RNA和某些特定的蛋白质（如组成纺锤丝的微管蛋白）能量的准备。 完成了细胞分裂所必须的物质准备和能量准备，2－3h或稍长。 （4）分裂期（M期） 将S期成倍增加的遗传物质形成染色体，然后再均分到两个子细胞中。时间较短1－2h。 2.细胞系的生长过程 原代培养： 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 细胞系 cell line，细胞株 cell strain 有限细胞系 无限细胞系 体外培养细胞寿命的三个阶段 原代培养期:新鲜组织自体内取出在体外培养至第一次传代的时期。 传代期：细胞能传代的时期，约1周左右可重复一次，持续数月。 衰退期：此时一般的有限细胞系的细胞虽仍能存活，但增殖缓慢并逐渐完全停止，进而衰退死亡。 3.每代贴附生长细胞的生长过程 滞留期：包括游离期，贴壁期及潜伏期 指数增长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料等 潜伏期: 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 三、培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要：基本营养物质和促生长因子 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ 气相: 5% CO2 CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压:290mmol/L 3 无污染 4 无毒 四、仪器设备及培养室设置 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，培养板，冻存管 超净台 CO2培养箱 滤 器 五、细胞培养基本技术 1.无菌操作 防污染是关键，操作中尽可能无菌。 须注意以下几个方面： （1）培养前准备 a.开始前制定好实验计划和操作程序 b.事先做好有关数据计算 c.把所需物品放至操作场所后，消毒。 （2）培养室和超净台消毒 培养室每天用2％新洁尔灭拖洗地面一次，紫外消毒30-50min。 注：a.消毒时物品放置不能过多或重叠。 b.移液器、废液缸、试管架用75％酒精擦后 置超净台紫外消毒。 c.细胞及培养液不能照紫外。 （3）洗手和着装 进入培养室前彻底洗手，戴口罩和帽子，用75％酒精或0.2％新洁尔灭擦拭手及前臂。实验过程中手触及可能的污染物品和出入培养室都要重新洗手。 （4）无菌培养操作 a.实验前先点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口，都应在火焰近处并经灼烧进行。 b.工作台用品摆放合理有序，一般酒精灯在中间，右手用物（如加样枪）放右侧，左手用物（如培养基）放左侧。 c.操作时，手不要接触瓶口，培养基不要过早打