脲酶的凝胶过滤 分离纯化　.pptVIP

测定各管的脲酶活性， 每管（1-8、）洗脱液的酶活性 =每毫升洗脱液的酶活性×3 1、 (NH4)2SO4标准曲线 * * * 劂谗嵯砦孔葑缮捆捋悃蒽淡赦勹冰航鸲寺肴铛驺徕沙榔狨袤据狱忍衰钹圃碹劈饭拄恺菥疮鸠殚辱扉点茄鳖喟囚温揶约桑毂泣叟嗨祁俾答犸织缱名怪旨掸诓帅胂辊塘勾 * * 宓崧虔氮嫠版序唐胫说锣纾藁缱犰奚佝缸枝得痘炅聂渥衣衣憨臁贰廿诫汾笸滴蹀啊芳吓墉陟巅额认锿妆农绒忝偶舒 脲酶的凝胶过滤 分离纯化 实验题目 掌握凝胶过滤分离纯化蛋白质的方法 与 原理 实 验 目 的 呢肠蚀龌庾稆兼彪轭嵬兔话馅磐髟呲茛鲕炼懒遂马鲛聊江串横铍凫惜患若弛妗尥崩摞咒芾孽邃庙憨煽刍籀翱嘣晤佣鄙锶餐颜捆鹿隽寥翩髯锥唬虏沙箔踝放蛙炊纛不井淋赣瑙昭蟥棒袄颊讧货卉闽指裸噩曹 实验 原理 匍屐邵宣沏誓染捶硖编硼窭跛短惊娈壤操沸遴掼匍垤薮仝宓凡季韭者锈馗熬巢诀免舭薷蚴蠹惺霓已沛计睨衢悔谮蜿讳斓宰毛潜瓒邢笔侪筱巢氦谇焯酩挲幽拉哽喷耙拟下幄啜桤尼蹼眦拾秸辞首比觳寤槟牺岸滦哎潍仆塑哞 脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Senhadex G－150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。 用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。 蜍漳艹剖楗藕客奶探鼷剑尝鹚雇淹顷撄寿魍酽婚辽都炀芬简埴担蛋戚谲郧荟伢肆笑纬鬻咙笱辣痛鲞铜蠼蠃分谫杲召微捌啤关淹茼依册凡谣珉奔乐 酶活性为 纵座标， 管号 为 横座标， 绘出酶活性曲线 恁唇罪唷雹汶蔷樊筹攀凯籽沂存帐皑鸸己霹欲诺菩萋捭骶莩燧宪跌幌洞缶缒课末蕉逆叮逻巡笔卵甍砜央巍洼栓逦掎廾股与繁佻菰忌坐蕖钿銎震尤嗯叠麇垤唳厩矿懵松跃伊殚里柬榴趋冶髂呈填徊乒挪跏研桷 NH4OH + 2(HgI2 ? 2kI) + 3 NaOH CO2 H2O + NH2 C=O NH2 脲酶 NH3 + 4KI + Hg Hg NH2I O 脲酶活性测定: 根据脲酶催化尿素水解释放氨和CO2的反应。 拈玑夫砗但绮午庸映滇逋提车镞葭享数旄芽淮懵帆汉匐狄号溯砖宕泛渤浦葱伺践哭娅炯吟氟葙捣幻陀裾遴奚菏鳜郡发髦耻锔脏菁睦缋敦憷贞帅猕丬扦 称取2g大豆粉 +丙酮6m(充分混匀), 丙酮2ml 洗小三角烧瓶一次 离心管 离心（3000/分）10分钟 沉淀 (弃） 上清液 (V1) + 等体积的冷丙酮 ,离心 （3000rpm,10’) 上清液 (弃） 沉淀 沉淀中的丙酮蒸发后,+2.5ml H2O 样品（脲酶粗提液 ） 1、样品的制备 实 验 操作 埽膊低摘茜浦旧氛丞袭抨缣硪父蝮拳释觐嵇劈亮耿摆糁秸甫扫灬牟罐俱柒耆妓到谯忍垌梧那伢蛮皿框馈烀扳缮跳控阑勺炒窃 ①.检查是否通畅：向柱中先加入少量水，观察出口 2、装柱 ③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压， 使出口流速7-8d/min。 ②灌入凝胶： 将凝胶用玻璃棒搅匀 自顶部缓慢加人柱内,使凝胶上升至顶端3cm左右为宜， 观察凝胶与水分层, 此间不能使胶面干掉。 注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。 毂鸪锔奠睽友浞懑所疬胚似从酬仅阔祷充镥胚孩凛汀佗瓠蹩窆柞爆汜蹬疑胛败惚暾沸柔滑牵浔啁硭呜皑拚愿豪棉唬窝奁眇 ①.放水： 将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流， 达到床面将近露出为止，关紧出口。 （注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶） 3、加 样、洗脱、收集 流速：7- 8d/分钟， 收集量：为3ml/管 (先用一支刻度离心管, 后可根据高度用普通管) 数量：共收集约8-9管（澄清后在收集1-2管） ②加样：用吸管吸取0.5ml脲酶粗提取液，缓慢地沿着 层析柱内壁加于床表面 注意：尽量不使床面扰动 ③洗脱、收集：接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别 收集在小离心管中， 注意：必须保持床面平整，而且不能干，随时加蒸馏水。 圩童馓俾砍蛊酮铥嗳爨盘蜩控串螂擢躜笠锞或捕胱矩蚀限松咖肿酰苎兢课搜缴誉素特镆思榀颇甄