[高等教育]基因操作中大分子的分离分析.pdfVIP

第四章 基因操作中大分子的分离和分析 第一节 DNA的分离与提取 DNA 的提取与纯化是基因工程操作的重要技术。由于基因工程操作大部分要靠生物酶来 进行，因此对 DNA 的质量要求十分高，不纯的 DNA 往往是整个工程的限速因素。DNA的提取 与纯化主要技术为碱抽提法(碱变性抽提法)、煮沸法、氯化艳超离心法、柱层析法等，因方 法的简繁、费用的高低、对设备的要求及产物质量的严格程度而各具优缺点。 分离质粒 DNA 的方法众多，其依据是利用分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行分离。目前常用的有碱变性抽提法、煮沸法、去污 剂 (如 Triton 或 SDS)裂解法、羧基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法等。碱变 性抽提法和煮沸法比较剧烈，它们可破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体 DNA 变性，而 共价闭合环状 DNA(covalently closed circular,cccDNA)由于拓扑缠绕，两条链不会互相 分离。当外界条件恢复正常时，质粒 DNA 的双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分 子，而较大的线性染色体 DNA 则难以复性，这两种方法适用于较小的质粒。去污剂裂解法则 比较温和，一般用来分离大质粒(15kb)。以上各种方法均有利弊，有的难以控制，有的得 率不高，有的手续繁琐，还有的纯度不高。因此在制备质粒 DNA时，不但要考虑该质粒特性: 如质粒宿主的菌属、是否需要用溶菌措施、质粒 DNA 产生缺口、拷贝数、构型、复制型是否 需要扩增，还要考虑提取质粒 DNA 的用量与用途、用初筛比较相对分子质量大小、进行酶切、 作探针、测序等以及提取方法的成本、程序、重复性、纯度、实验室具备的条件等，选择最 佳的实验方法。 基因组 DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 及 PCR 分离基因等。在构建基 因组文库的部分酶切反应中，若起始 DNA 较短，则许多产物的一端带有机械断裂的末端，从 而使两边都带适合末端的产物片段较少。因此，除非起始的 DNA 长度比用来克隆的片段至少 长 4 倍，否则有用片段的产量会相当低。例如用粘粒构建基因组 DNA文库，起始 DNA 的长度 必须超过 80kb。分离基因组 DNA 时应在尽量温和的条件下操作，如尽量减少酚-氯仿抽提， 混匀过程要缓慢，以保证得到较长的 DNA 片段。如需要更长的片段，最好采用甲酚胺-火棉 胶袋法，该法可得到 2OOkb 以上的 DNA(Kapies 等，1987)。 不同生物(植物、动物、微生物)的基因组 DNA 的提取方法有所不同；同种生物的不同种 类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种 特殊组织的 DNA 时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的 DNA大分子。 尤其是组织中的多糖和酚类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用，因此对富含 这类物质的材料提取基因组 DNA 时，应考虑除去多糖和酚类物质。 有时所得的 DNA 纯度不符合进一步操作的需要，则需进一步纯化。质粒 DNA 纯化的方法 都是利用质粒 DNA 相对较小和它的共价闭合环状特性。常用的纯化方法有 CsCl-溴化乙锭梯 度平衡离心和 PEG 差别沉淀。前者可完全分离闭合环状 DNA分子，适用于纯化易于产生切口 １ 的较大的质粒(l5kb)。后者省钱省时，但不能有效地将质粒 DNA 的切口环状分子与闭合环 状分子分开。然而，这两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒 DNA， 包括用于哺乳动物细胞的转染，以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。许多厂家根据 离子交换、凝胶过滤等方法的原理设计的各种商品层析柱，也可快速分离纯化微量的质粒 DNA。基因组DNA 可用Oligo(dT)-纤维素、PolyU-琼脂糖柱层析、超离心、分子杂交、电泳 等方法纯化。 1.1 DNA的来源 天然 DNA 包括染色体 DNA、病毒 DNA(噬菌体 DNA)、质粒 DNA、线粒体 DNA和叶绿体 DNA 等，可以从不同的生物体中提取。 1.1.1 染色体DNA 6 原核生物和真核生物均含有染色体 DNA，其分子巨大，可长达 10 kb，小的也