方法和流程见图1-ThermoFisherScientific.PDFVIP

KingFisher 磁珠纯化系统在多肽和蛋白质生物标记物（Biomarker ）研究中的应用 原文：Automated Profiling and Identification of Endogenous Peptidomic Markers in Human Plasma 欧阳志荃 编译 生物标志物（Biomarker）是指可供客观测定和评价的一个普通生理或病理或治疗过程中的某种特征性的 生化指标，通过对它的测定可以获知机体当前所处的生物学过程中的进程。检查一种疾病特异性的生物标 志物，对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控可能起到帮助作用。寻找和发现有价值的生 物标记物已经成为目前研究的一个重要热点， DNA，RNA，蛋白质，小分子多肽，糖类作为分子标记物 已经大量用于基础和疾病诊断研究和应用，基于多肽和蛋白质生物标记物的蛋白组表达模式诊断是一种很 有前景的疾病早期检测。 Thermo Fisher 联合马赛诸赛州综合医院建立了Biomarker Research Initiative in Mass Spectrometry (BRIMS) 中心，该中心建立了基于磁珠的色谱分离技术研究血清中的分子标记，以一种简单、有效和可重 复的方式每天处理上百的样品。采用基于疏水相互作用的反相RPC磁珠（Reverse Phase Chromatography， Dynabeads RPC18 ）可以从血浆样品中结合多肽片段，经乙氰洗脱，获得高质量的肽段表达谱。通过比较不 同条件下肽段表达图谱的差异，以寻找潜在的可能血浆生物标志物。 本文介绍BRIMS 中心基于全自动磁珠的色谱分离技术从人血浆中分离鉴定内生多肽谱标记物的研究，发 展一种自动化、基于vMALDI 技术和计算软件的从人血浆中内生肽差异分析。 前言：近十年来，对生物标记物的兴趣经历爆发性的过程，越来越多的研究开始关注多肽组质谱图特 征性的变化作为不同疾病变化指示剂在医疗方面的潜在应用。在人血浆多肽组中含有约5000个独特的肽段。 开发一种能准确鉴定多肽组中相关成分的强大的方法势在必行，不仅可以加快对疾病生物学状态的了解， 也加强开发这些疾病生物标记的能力。 方法和流程 （见图1）： ①基于磁珠的样本制备；②vMALDI质谱采集；③数据库检测和软件分析。其中KingFisher 96磁珠纯化系统 参与血浆中多肽样品的制备。通过疏水反向RPC磁珠，选择性的分离和富集人血浆中发现的内生多肽。经 过vMALDI质谱采集以及一种新的差异表达分析的软件（BioSieve™），该软件能自动鉴定经vMALDI MS 质谱检测的、在统计学上具备明显变化相关信号强度的变化。这种结合和检测多肽水平变化的方法，可以 精确检测加有6种人工合成多肽标准品的人血浆样品。 图1：（A ）工作流程，（B ）常规质量范围（700-2000m/z ）和(C)高质量范围（2000-4000 m/z ）vMALDI人血 浆质谱图，血浆经疏水相互作用的反相RPC磁珠富集，星号标记的是加入的多肽标准品。 实验过程和结果： 一、样品自动化准备 为了模拟在人血浆中的时间流程试验，血管紧缩素I （Angiotensin I ）， 纤连蛋白片段（ fibronectin fragment ）（1377-1388），蛙皮素（bombesin ）， ACTH 片段（18-39 ）胰血糖素（glucagon ）和氧化的胰岛素B 链（oxidized insulin B chain ）（Sigma, St. Louis, MO）等6 种多肽标准品按以下不同 浓度被加入到解冻的人血浆中：两个多肽浓度按2 倍递减，【Angiotensin I (640-20fmol/μL), glucagon (64 -.2pmol/μL)】, 两个多肽浓度按2 倍递 增【fibronectin (30-960fmol/μL), ACTH (80-2560fmol/μL) 】，两个多肽浓 度 固定 【bombesin (300fmol/μL) ， Insulin B chain oxidized (1600fmol/μL) 】，产生6 种不同的血浆样本。将加有多肽的血浆样品置 于冰上直至分层。将所有6 种经处理的样品各取25ul 加到96 孔板中， 并设置未加多肽标准品的血浆作为阴性对照，含血浆样品的96 孔板放 入 KingFisher96 磁珠分离系统进行处理，通过专利的磁珠转移技术， 将磁珠从一个孔