[医药卫生]高效液相色谱.ppt

高效液相色谱法原理 当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。 色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间分布的图象。色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线，流出曲线上的突起部分。 保留时间(tR)： 被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用tR表示，常以分（min）为时间单位。死时间(t0) ：从进样到峰出现极大值的时间称为死时间。 分离度 不对称度与拖尾因子 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 基本原理 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的应用 HPLC的发展方向 进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱 分离系统 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法： 即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法： 当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF等。 填充方法： 填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。 分离系统 包括柱管与固定相两部分 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm 凝胶色谱柱内径3～12mm 微柱内径1-2mm，长1-5cm 制备往内径较大，可达25mm 以上 检测系统 紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm, 体积约为1~10 ?L。 HPLC分析中，约有80%的物质可以在254 nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。 检测系统 响应特性 选择性检测器，如芳烃类化合物的检测 灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质 线性范围宽，104-105 对温度及流动相的改变不敏感 适合梯度洗提 HPLC常规检测器 检测系统 示差折光检测器 光源 调零 光学零 参比 样品 平面镜 透镜 光电转换 记录仪 放大器 遮光板 利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。 为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。 检测系统 荧光检测器 利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光(荧光)的性质来进行检测的，是一种高灵敏度和高选择性的检测器。对不产生荧光的物质，可使其于与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。 荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。 检测系统 安培检测器