[理学]第二章 细胞生物学技术.pptVIP

教室及实验室规则 教室： 提前10分钟进教室，作为辅导时间； 上课前、下课后，班长安排值日擦黑板。 手机关上； 上课保持安静； 有问题举手提出。 实验室： 预习本次实验的实验指导； 至少提前5分钟进实验室； 穿隔离衣； 实验用品：铅笔、橡皮、直尺、实验报告纸等； 遵守课堂纪律。 关于考试 考前不划重点。 考试题型（仅供参考）： 名次解释 简答题 判断题 选择题 填空题（必要时） 教学活动安排 实验课第7、9、13、15、17周进行； 期中考试：第九周进行。 师生座谈会：第6周进行（必要时可在14周进行第二次）。 二、光学显微镜技术 （一）普通光学显微镜技术 （二）荧光显微镜技术Fluorescence Microscope （三）相差显微镜技术Phase Contrast Microscope （四）激光扫描共焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Mircroscope 第二节 细胞化学技术Cytochemistry （一）酶细胞化学技术Enzyme Cytochemsitry （二）免疫细胞化学技术Immunocytochemistry 免疫细胞化学技术的基本原理 第三节 细胞及其组分的分离纯化和分析 （一）流式细胞技术Flowcytometry （二）细胞分级分离Cell Fractionation 第四节 细胞培养技术Cell Culture一、体外细胞培养技术 培养细胞的优点是可在离体的条件下，根据需要人为的建立培养条件，来观察和研究细胞生命活动的规律，而不受体内复杂环境的影响，是对细胞进行实验性研究的极有用的手段。 体外培养的动物细胞可分为原代细胞 Primary Culture Cell 和传代细胞 Subculture Cell。 原代细胞：指从机体取出后立即培养的细胞 如将实体组织 (肝、肾)剪碎并用胰酶消化后制成的细胞悬液,直接进行肝细胞或肾细胞的培养。 传代培养：将原代培养的细胞从培养瓶中取出，进行大数量的培养。 可重复传代几周或几个月。传代细胞能显示出其来源组织的分化特征。 如成纤维细胞能不断地分泌胶原;胚胎骨储肌细胞能融合成巨大肌细胞，并具有收缩的功能等等。 大多数的脊椎动物细胞，在一定的培养条件下经过有限次数的分裂后死亡。 细胞系 (Cell line) 具有无限增殖能力的的培养细胞（变种细胞），这种细胞能无限地传代。 著名的Hela细胞就是1952年从人宫颈上皮癌细胞来源的细胞系。 电子显微镜技术原理和方法、胚胎干细胞培养技术、细胞融合技术、以及细胞分子生物学的研究方法讲在后续课程和实验课中介绍。 二、细胞融合技术 （一）细胞融合 细胞融合(cell fusion)是指二个或二个以上细胞合并形成一个细胞（异核体）的过程。 自然融合 人工诱导融合 细胞融合剂 乙二醇 仙台病毒 细胞融合技术的应用 基因定位 证明膜的流动性 聚合酶链反应(PCR) 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 一、概 述 聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 二、原理和方法 PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对; (3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成. 由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。   （一） PCR反应中的主要成份 1. 引物： PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： (1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。 (2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四种碱基应随机分布