自动洗板机与ELISA洗涤问题的的解决.ppt

自动洗板机与ELISA洗涤问题的解决 上海精睿生物科技发展有限公司 上海市鑫都路2699弄80号102室 联系电话：021传真：021公司网址： www.精睿.中国 免费咨询电话： 400-820-3840 酶联免疫吸附实验（ELISA） 酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 上发展起来的一种新型免疫测定技术。 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 ELISA基本流程（上） 1.包被：用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5～20μg／ml，按100ul/孔加入酶标板，4℃包被过夜。 2.洗板：次日弃去孔内液体，除去残留液体，加入洗涤液（约280-300ul/孔），漂洗2-3次，每次3-5min。 3.封闭：按200-250ul/孔加入封闭液，室温2-3小时或37℃1-2小时，也可4℃封闭过夜，然后弃去孔内封闭液。 4.样品处理：用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度 5.标准液：用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度（定性分析可省略本步骤）； ELISA基本流程（下） 6.加样：按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照，室温或37℃?孵育30-60min； 7.洗板：同步骤2； 8.加酶标抗体：酶标抗体的稀释按产品说明书，按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体，室温或37℃孵育1小时； 9.洗板：同步骤2 10.加底物液显色：按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液，室温避光反应15～30分钟。 11. 终止反应：于各反应孔中加入50ul的终止液。 12. 结果判定：在酶标仪上于405nm(若以ABTS显色，则410nm)处测OD值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值，若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。 酶联免疫吸附实验（ELISA）的洗涤 在酶联免疫试验中，洗板是非常重要的过程。酶联免疫试验(ELISA)洗涤过程虽不是一个反应过程，但却也决定着实验的成败。 ELISA就是通过洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的，通过洗涤以清除残留在微孔板中未能与固相抗原或抗体相结合的物质，以及在反应过程中的非特异性吸附于固相载体上的干扰物质。 聚苯乙烯对蛋白质的吸附是普遍的，在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，洗涤时又应将这些非特异性吸附的干扰物质洗涤掉。 洗涤如不彻底，特别是最后一次，如有酶结合物的非特异性吸附，将使空白值升高。另外，在间接法中如血清标本内的非特异性IgG吸附在固体上而未被洗涤，也将与酶标抗体作用而产生干扰。 在ELISA操作中，洗涤是非常关键的，应引起操作者的高度重视 。 每进行一次ELISA，至少有3至4步实验涉及洗板、每步3至4次，总共十几次，有一定的工作量和劳动强度。 手工洗板与机器洗板 通常微孔板条的洗涤主要有两种方式，一种是手工洗涤，一种是使用洗板机洗涤。前者对工作量不大的临床实验室，可能较为经济方便，但如操作不规范，有可能会造成板孔之间的相互交叉“污染”。因此，使用洗板机洗涤，不但可减轻实验室技术人员的劳动强度，而且有利于保证ELISA测定的特异性。 洗板机经过数十年的发展，由最初简单的多头吸和加液系统，发展到了今天的融合多种洗涤功能于一身的全自动洗板机，如震荡、涡流、底部冲洗、两点吸液、连续式冲洗等多种功能方式，并且冲洗压力、冲洗距离、冲洗时间可根据需要来进行调节，此外有的还具有不同类型微孔形状的选择功能。 洗板环境：洗板环境实际上是一组有利于改进洗涤效果的参数及洗涤动作。对于具体应用来说，有的很实用，效果也不错，如底部冲洗、两点吸液、震动、交叉吸液(漂洗)等；而有的可能实际洗涤效果并不佳。对洗板参数和洗涤动作的精心全面的设计，应可以取得很好的洗涤效果。 洗板机洗涤板孔的一般机制 洗板机洗涤板孔的一般机制主要涉及到两个物理作用过程，一是通过加液和吸液对原板孔中液体的一个直接稀释过程，其优劣的评价指标是每次吸液后，板孔中液体的残留量；二是与加液和吸液之间所间隔的时间有关的对板孔内残留液体的间接稀释过程，这个过程与液体的扩散有关，间隔时间越长则扩散越充分。 因此，在洗板机的研制中，要达到最佳的洗板效果，就需要围绕这两个方面来做文章。首先要尽可能的降低每次吸液后板孔内液体的残留量。这是评价洗板机洗板效果的最为关键的参数。通常为降低洗板机每次吸液后的液体残留量，可采用两点吸液的方式吸液。其二是加快扩散的速率