2DNA重组克隆的单元操作-正.pptVIP

冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法 3.凝胶DNA片段回收技术 4.连接、转化扩增、筛选 鸟枪法克隆目的基因的局限性 ① 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 ② 不能获得最小长度的目的基因 ③ 不能除去真核生物目的基因的内含子结构 B cDNA法 cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性 1.mRNA的分离纯化 cDNA法克隆目的基因的基本战略 mRNA 2.cDNA第一链的合成 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ cDNA第一链 引物 退火 逆转录酶 dNTPs 3.cDNA第二链的合成 煮沸 NaOH 自身引导法：获得的双链cDNA 会有几对碱基缺失 AAAAAAAAAAAAAA 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT OH 3’ Klenow dNTPs S1 DNApol dNTPs RNaesH 置换合成法：获得的双链cDNA十分接近全长 5‘ppp’5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ S1 AAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTT 5’ 5’ AAAAAAAAAAAAAA 3’ 3’ T4-DNA ligase dCTP TdT 引物合成法：获得的双链cDNA 能保留完整 5‘ppp’5 G G AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ 3‘ HO 5‘ppp’5 G G AAAAACCCCCCCOH 3’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG 3‘ HOCCCCCCC TTTTTp 5’ 5‘ pGGGGGGG AAAAAOH 3’ NaOH 退火 Klenow dNTPs 4.双链cDNA的连接 ① 平头末端直接与载体连接。 ② 平头两端分别接同聚物尾。 ③ 加装人工接头。 5.转化扩增、筛选 cDNA法分离目的基因的基本程序 1.完备分离程序 提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。 2.特异分离程序 3.差异分离程序 利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA。 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 ② 细菌或原核生物的mRNA半衰期很短 ③ mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难 ④ 仅限于克隆蛋白质编码基因 cDNA法克隆目的基因的局限性 ① 并非所有的mRNA分子都具有polyA结构 C PCR法 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 PCR法克隆目的基因的基本程序 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶 链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。 使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目的 基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必 需的双引物。 PCR法定向扩增目的基因的基本原理 5‘ 5‘ 目的基因 5‘ 变性 加热 5‘ 5‘ 引物 退火 5‘ 5‘ 底物 延伸 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 加热 变性 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 5‘ 退火 引物 底物 延伸 加热 变性 引物 退火 底物 延伸 1 2 3 （72oC） （40－65oC） （94oC） Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物末端带一个A，克隆时