fsq酶切步骤.docVIP

2. DNA酶切反应 载体和PCR产物分别用以下条件进行双酶切（反应体系均为50ul，37℃，酶切3小时）： pBlue/Pyes2 50ul 插入片段 50ul 10x buffer2 5ul 10x buffer2 5ul DNA ≤2ug（20ul） DNA（A,B,C,D） ≤2ug(20ul) 100xBSA 0.5ul 100xBSA 0.5ul HindⅢ 1ul HindⅢ 1ul XbaⅠ 1ul XbaⅠ 1ul ddH2O 32.5 ddH2O --- 1) 将清洁干燥并经灭菌的ep管(最好0.5ml)编号，分别标记：A;B;C;D;pY;pB， 然后安装上表添加各剂量。 2) 添加好个试剂后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 3) 混匀反应体系后，将ep管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。 4) 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。 5）电泳： 点样6组： Marker;③酶切后的载体pYESⅡ；④酶切前的载体pBlue；⑤酶切后的pBlue。 6)进行切胶回收。 7）采用Sanpre柱式PCR产物回收试剂盒回收双酶切后的目的DNA。 3． 连接 上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜（5h）。连接体系如下： 试剂 剂量/ul（10ul） 试剂 剂量/ul（10ul） 载体pBlue 2 载体pYES2 2 pBX 3.5 pBX 3.5 10xT4 buffer 1 10xT4 buffer 1 T4 DNA ligase 1 T4 DNA ligase 1 ddH2O 至10uL ddH2O 至20uL 1 X ?T4 ?DNA? 连接酶缓冲液 [ 50 mM Tris-HCl（pH 7.5 @ 25 ），10 mM MgCl2，10 mM DTT，1 mM ATP]。推荐 DNA 5 末端浓度为 0.1－1.0 μM。16 温育。 DNAX pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650 是该双链DNA 的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bpDNA=0.66μg,载体pYES2是5.8kb，则0.03pmol 为 0.03×5.857×0.66=0.116μg;载体pBlue是3kb，0.03pmol为0.0594ug。 目的DNA是1.3kb，0.3pmol是0.257ug. 如果是1:5，则加128ng。 4. 转化：a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入400μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 5. 扩培和检验 平板在37℃恒温箱中培养12-16小时，发现生长有清晰的菌落时，进行挑单菌落扩培。每样挑5个菌落，分别培养在装有1mL LB+1ul Amp培养基的1.5mLEP管中，37℃，200转/分钟。 6. 杆菌DH5α制备 1) 取保存的大肠杆菌DH5α接种于LB固体培养基，37℃培养过夜不超过16。 从大肠杆菌的培养平板上挑取单菌落接于含2mL LB液体培养基的试管中。37℃200rpm振荡培养过夜。 以1%的接种量将过夜培养的菌液接种于LB液体培养基中，37℃ 200 rpm振荡培养3h左右OD600=0.3)。 4) 将菌液转移到1.5mL离心管中，冰上放置10min4000rpm, 离心10min 回收细胞。 5) 彻底去上清后，加入1mL冰冷的0.1mol/L CaCl2，悬浮沉淀，冰浴30min。6) 4℃, 4000rpm, 离心10min彻底去掉上清冰上加入0.1mL 0.1mol/L CaCl2悬浮细胞7) 加入15甘油，混匀，置于-80℃保存。 8) 以标准质粒确定感受态细胞的转化率。 转化感受态大肠杆菌 1) 取出-80℃保存的大肠杆菌感受态细胞，待感受态细胞刚解冻时，将连接产物加入其中，充分混匀，冰浴30min。 2) 42℃休克90s (注意不要摇动离心管)，冰浴5min。 3) 加入400μl不含Amp的LB培养基，轻轻混匀4) 37℃, 小于100 rpm振荡培养45min?1h。 5) 4000rpm离心10min, 吸掉部分上清剩余约1