应用FLIPR钾离子通道检测试剂盒对hERG通道阻断剂特性的分析.PDFVIP

FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统应用系列 （6 ） 应用FLIPR 钾离子通道检测试剂盒对hERG 通道阻断剂特性的分析 优势 简介 药物诱导的hERG (human ether-a go-go-related FLIPR 钾离子通道检测试剂盒(Molecular gene) 离子通道被阻断可能导致严重的致死 Devices cat. #R8222) 含有Tl+敏感染料、 性室性心律失常——尖端扭转型室性心动过 屏蔽染料、200 mM K2SO4 、50 mM 速（torsade de pointes, TdP）。近年来，一批 Tl2SO4 、5X 不含氯离子的缓冲液以及 FDA 已批准药物由于其对hERG 的脱靶效应 HBSS + 20 mM HEPES 缓冲溶液。每个包 而被迫从市场上撤出。由此，愈发凸显了在 装的试剂盒可以完成10 块96- ，384， 药物研发早期阶段开展候选药物 hERG 安全 或1536 孔板。实验检测流程见图2 。 性筛选的重要性和快速增长的需求。本文重 点阐述了一种新型钾离子通道检测试剂盒在 化合物准备 FLIPRTETRA 高通量实时荧光成像分析系统上 疏水性化合物由于非特异性结合到化合物板等实验耗材 对 hERG 阳性化合物的效应进行了评估和检 中，会影响到其显著的效能值。在本实验中，化合物首先 测。实验根据钾离子(K+)通道对铊离子(Tl+) 在100%DMSO 中被稀释，然后在实验前立即转移到含HBSS 的通透性，采用了对铊离子敏感的荧光染料 + 20 mM HEPES 缓冲溶液的玻璃衬里的多孔板中 作为指示剂。实验对几种常见的 hERG 阳性 抑制剂的药理效应进行了检测，结果与 IonWorks Barracuda® Plus 全自动膜片钳系统 得到的数值作比较。 材料和方法 FLIPR 钾离子通道检测试剂盒 （图1）含有铊离 子敏感的指示染料。在开始染料加载步骤中，含 有乙酰氧基甲 （AM ）酯的铊离子指示染料通过 被动扩散方式穿过细胞膜进入细胞内部。细胞质 酯酶剪切掉乙酰氧基甲 （AM ）酯并释放出其激 活的荧光形态。另外，在细胞外采用了专利的屏 蔽染料技术从而降低了背景荧光信号的干扰。可 + + 通过向细胞溶液中加入混合的 K 和 Tl 或包含了 + Tl 的配体来激活钾离子通道。荧光信号的增强表 明了铊离子特异性地通过钾通道进入细胞内，从 图1. FLIPR 钾离子通道检测试剂盒原理 而对钾通道活性进行了功能性检测。 实验步骤 细胞稳定转染了人Kv11.1 （hERG ）离 子通道的中国仓鼠卵巢（CHO ）由 ChanTest 公司（Cleveland, OH ）提供。 实验开始2 天前在黑壁底透的384 孔板 中按照每孔6500 个细胞的密度种植细 胞，培养基中包含了筛选抗生素并在 图2. FLIPR 钾离子通道检测试剂盒工作流程 37°C 和 5% CO2 条件下培养。实验前 24 小时生长培养基更换为含四环素的 诱导培养基。实验前4 小时细胞从37°C 转移至28°C 条件下培养以增加hERG 通 道的表达。然后细胞板加入染料在室温 下避光孵育一小时。 为进行药理学特性分析