[农林牧渔]4第四章目的基因的制备2.pptVIP

第四章 目的基因的制备 cDNA文库按所用载体分: 质粒cDNA文库(含克隆数少，适于高丰度mRNA) 噬菌体cDNA文库(含克隆数多，适于低或极低丰度mRNA) 根据经验公式,提高目的基因mRNA在总mRNA数的比例（f）可减少cDNA文库的克隆子数,构建前用各种方法富集和提高目的mRNA丰度,可降低文库的复杂性和分离难度. 基因化学合成法的局限性： 主要适用于一些分子较小的基因的合成； 只有在基因的全序列或其表达产物蛋白质的氨基酸序列的结构阐明之后，基因合成才有实现的可能。 Thank you * * 第二节 目的基因的制备 三、cDNA基因文库的构建及目的基因的分离 （1）c DNA文库的概念 直接从生物体分离目的基因很困难，但在某一特定发育期和特定组织仅得以表达的基因仅占总基因数的15%，产生mRNA,因此从mRNA出发分离目的基因，大大降低难度。 某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体，即cDNA基因(部分)文库。 表达型：必须采用表达载体(如λgt11) 。插入片段可表达融合蛋白，有活性、抗原性。常采用能与表达产物发生特异性结合的抗体或化合物进行标记筛选。特别适用于氨基酸序列不清楚的蛋白质的筛选 。 非表达型：可用一般载体(如λgt10) ，适用于已知氨基酸顺序或其同源序列蛋白质，根据氨基酸密码子，人工合成寡核苷酸作为探针进行筛选。 cDNA文库可分为 分离细胞总RNA，并从中分离纯化出mRNA （含oligo（dT）的纤维素柱） 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 双链cDNA 的合成 常用方法:第一 第二 第三 第四 第五 将合成的双链DNA重组入载体，导入宿主(大肠杆菌)增殖 （2）cDNA文库的构建 要获得高丰度的某mRNA, 必须选好适当的材料. c DNA基因文库大小理论公式 cDNA的克隆数 =细胞总mRNA数/细胞中某种mRNA的拷贝数 实际需构建的最小值远超过公式理论值 经验公式： N=ln( 1-P ) / ln( 1-f ) N： c DNA基因文库必需的克隆数 P：文库中含目的基因c DNA片段的出现概率 f：某mRNA 的丰度 / 总mRNA数的比值 （3）mRNA的丰度与cDNA基因文库大小的关系 N=ln( 1-P ) / ln( 1-f ) 与基因组文库相比,在构建和基因分离方法上有以下优越性： 某些RNA病毒分离的唯一方法; 筛选简单易行； 假阳性概率降低; 直接用于基因工程操作; 研究真核细胞mRNA的结构和功能. （4）cDNA克隆的优越性 局限性: ①所含遗传信息远小于基因组文库,受细胞来源或发育时期的影响; ②不能直接获取基因内含子和编码区外的调控序列的结构与功能信息; ③高丰度mRNA的cDNA比例较高,分离较易,而低丰度的比例较低,较难. 四、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因 （1）套式PCR （2）反向PCR （3）不对称PCR （4）锚定PCR （5）长程PCR （6）反转录PCR （7）锅柄PCR （8）Alu PCR 若已知目的基因的全序列或其两侧序列，可通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效地扩增出所需的DNA片段。 要求待扩增的DNA片段的序列已知或至少其两端20bp左右序列已知。 利用常规PCR只能合成1kb以内长度的DNA片段 特殊类型PCR可满足多种需要。 五、基因的化学合成（p204） （1）基因化学合成的概况 1979年首次化学合成有活性的大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因.现用DNA合成仪快速合成寡核苷酸片段,再用酶化学法获得目的基因DNA片段. （2）基因的组装方式 150～200bp以内可化学合成。要获得较大的高等真核基因必须设计一种特殊方法,能把合成的DNA片段构建成完整的基因的过程，称为基因组装。 20世纪70年代提出,常用的有两种: 全片段酶促连接法: 酶促填充法: Other RNAs and cellular components flow through column Poly(A) RNA blinds to thymine nucleotides Messenger RNA with Poly(A) Tail (AAAA) Ribosomal RNA Lacking Poly (A) Buffer wash to release bound mRNA mRNA 为模板合成方法常用的有两种：一种如左图；另一种随机引物引导合成法。 随机引物引导的cDNA合成法： 根据