[医学]第14章基因工程2.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 基因重组：不同来源的DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。 重组类型：同源重组、特异位点重组、转座重组 （二）同源重组特点： ① 不需要特异DNA序列，而是依赖两分子间序列的相同或相似性（同源性）； ② 并且同源双链DNA分子必须紧密接触，相对应方能交换； ③重组时，两个DNA片段必须有一个发生断裂或有一段单链缺失。 Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为： (四).功能 1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。 2.是DNA损伤修复的重要机制之一。 自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生DNA转移和基因重组。 过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。 1.溶菌性生长途径：噬菌体DNA在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。 （四）细胞融合 人工的或自然发生的细胞合并形成多核细胞的现象。 2.特异位点： λ噬菌体重组的特异位点称attP(attachment site phage)，含P、O和P‘三个序列组成。大肠杆菌 的重组位点attB（ attachment site bacteria），含B、O和B`三个序列。O是15bp的核心序列，是attB和attP所共同的。而其两侧的序列是B，B’和P，P`,被称为臂。整合酶与两个核心序列都相结合。 1.H片段的组成和功能：①两端各有一个14bp的反向重复序列（特异重组位点-hix），二者方向相反。②中间是hin基因，编码特异的重组酶-倒位酶，催化H片段倒位重组。③ hin基因两端各有一个启动子（P），其中一个启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的H2和rH1基因表达，分别产生H2鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻抑蛋白可抑制远方H1基因的表达。 a.转座子(transposons) 概念：可从一个染色体位点转移到另一位点的分散的重复序列，也就是一段可以发生转座的DNA。 第 二 节 重组DNA技术 所有这些工作的基础都是重组DNA技术。重组DNA技术就是基因工程，是对基因进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、基因克隆和克隆基因的表达。 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 DNA连接酶(DNA ligase) ——基因工程的缝纫针 （三）目的基因 （1）能自主复制； （2）具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； （3）有多克隆位点（multiple cloning sites,MCS, ），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点,是外源DNA插入点。 （4）分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （5）具有适当的启动子、增强子等调控元件； （6）生物安全性好。 柯斯质粒是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。在柯斯质粒载体pHC79中，除了cos位点外，两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA序列，质粒DNA部分是一个完整的复制子，包括一个复制起始点和两个抗菌性基因ampr和tetr 重组DNA技术的基本过程： 1．? 载体的选择和制备——分； 2．? 制备目的基因片段——切； 3．? DNA片段的重组连接——接； 4．? 重组DNA导入受体细胞——转； 5．? 转化子的筛选——筛； 6．? 重组子的筛选——筛； 7．? 重组子的鉴定——鉴； 8．? 克隆扩增或表达——扩/表达； 9．? 基因工程的后处理——分。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求： 已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基 酸序列。 根据已知氨基酸顺序推导出基因的核苷 酸序，然后可用DNA合成仪人工合成目的基因。 先合成小片段，再将小片段依次连接成一个完整 基因链。人工合成方法一般用于较短的多肽或寡 肽激素基因的合成。如胰岛素原如图 抗药性筛选 蓝白斑筛选 Lac Z , I