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生物技术模块第一实验
第一实验:酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid)
目的
掌握酵母双杂交原理和方法。利用酵母双杂交方法在拟南芥转录因子AP2-EREBP家族中筛选与拟南芥Med25有相互作用的蛋白。
原理
酵母双杂交系统由 Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子, 如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain,DBD)和转录激活结构域(transcription-activating domain,AD)。DNA结合结构域可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。二个结构域可在其连接区适当部位断开,仍具有各自的功能。将两个待测蛋白分别与这两个结构域组成融合蛋白,并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用,就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与DBD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
图 SEQ 图表 \* ARABIC 1-1 酵母双杂交基本原理
酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母,然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合,形成二倍体,并检测报告基因的表达。
酵母双杂交系统由三个部分组成:(1)与DBD融合的蛋白表达载体,被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体,被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
酵母双杂交系统常应用在:(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用,同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。(2)用已知功能的蛋白做诱饵,在cDNA文库中寻找有相互作用的未知蛋白,以获取蛋白质相互作用的网络途径信息。(3)以功能未知的新蛋白去筛选文库,根据选到的靶蛋白的已知功能来推测该新蛋白的功能。(4)建立蛋白质相互作用的图谱。
使用酵母双杂交系统应注意如下问题:(1) 在筛选文库之前,要检测诱饵质粒转化后表达的诱饵蛋白本身能否激活报告基因。(2)由于诱饵蛋白的存在致使报告基因His产生渗漏表达(leaky)。一般情况下,在培养基中加入3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)可以有效地抑止His报告基因的渗漏表达。(3) 在完成筛选之后,需检测猎物蛋白是否自激活。
一个完整的利用酵母双杂交筛选相互蛋白作用的实验包括cDNA文库的构建,诱饵基因载体构建,载体转化酵母,报告基因渗漏表达滴定,酵母接合实验,报告基因表型的测定,诱饵蛋白与靶蛋白相互作用复验。本实验只完成酵母接合实验,报告基因表型的测定。
在本实验中,pDEST32质粒携带诱饵蛋白MED25,营养标记基因是Leu2,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109(Mata,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4△,gal80△,LYS2::GAL1UAS- GAL1TATA- HIS3,GAL2UAS- GAL2TATA- ADE2,URA3::MEL1UAS- MEL1TATA- lacZ,MEL1)菌株中;pDEST22质粒携带的靶蛋白文库来自拟南芥转录因子,营养标记基因是Trp1,转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Y187(MATα ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901,leu2-3, 112, gal4Δ, met–, gal80Δ, MEL1,URA3::GAL1UAS -?GAL1TATA-lacZ)菌株中。报告基因使用HIS3。诱饵载体和猎物载体的启动子都是酵母组成型强启动子ADH。
其中,拟南芥转录因子库是组分特异的库(specific libraries),相对传统全cDNA库而言,它不受组分的组织表达特异性、发育阶段特异性以及表达量低的影响,提高了筛选效率。该库由1000多个独立的克隆组成,筛选后不需测序。
图 1- SEQ 图表 \* ARABIC 2 实验材料示意
材料、试剂、仪器
材料
酵母菌株AH109含有pDEST32-bait 质粒 (Leu )
酵母菌株Y187(Matα)含有pDEST22- prey质粒 (Trp),共有4个不同基因
酵母菌
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