PCSK9基因D374Y突变体转基因猪的制备与分析-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2017,50(19):3808-3816 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.017 PCSK9基因 D374Y 突变体转基因猪的制备与分析 张雪，黄雷，阮进学，刘志国，程英，冯书堂，牟玉莲，李奎 （中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193） 摘要：【目的】前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9， PCSK9 ）基 因是人类高胆固醇血症（autosomal dominant hypercholesterolemia, ADH）的主效基因之一，其获得型突变与 人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y 突变体对低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）的降解能力比野生型蛋白强十倍，增加了患高胆固醇血症的风险，从而加速动脉粥样硬化的进 程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近，成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病 的猪缺乏，且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备 PCSK9 获得型突变体转基因猪，以模拟动脉血 管的病理学变化，加速发病进程，为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【方法】研究使用人 PCSK9 基因 D374Y 突变体载体，用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中，并通过体细胞核移植技 术获得了人 PCSK9 基因 D374Y 突变体转基因猪个体。通过 Southern-blot、实时荧光定量 PCR、Western-blot 等 方法，分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时，通过组织化 学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【结果】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现， 至第 7 天形成较大的单克隆点，且 PCR 检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段，说明外源片段在基因组中具 有完整性；将筛选得到的阳性细胞作为体细胞克隆的供体细胞，通过体细胞核移植技术获得了转基因猪个体。PCR 及 Southern-blot 检测结果显示，D374Y-PCSK9 基因可以完整的插入猪的基因组中，且有串联重复现象；RT-PCR 和QPCR检测结果表明，人PCSK9基因能在猪肝脏内正常转录且不影响猪内源性PCSK9 基因的转录，且在其它内脏 器官，如心、脾、肺、肾也能检测人 PCSK9 基因的表达，而猪内源性 PCSK9 基因在这些组织中表达量很低； Western-blot检测结果与RNA水平的检测类似。这些结果说明人D374Y-PCSK9基因成功整合到猪基因猪中，且能 够正常转录与翻译。通过组织化学染色发现，与野生型猪肝脏相比，克隆猪肝脏中LDLR蛋白水平极显著低于野生 型。另外，对克隆猪进行H.E.染色后发现其肝脏组织有明显的病理学变化，该结果说明，LDLR水平的急剧下降有 可能是导致肝脏病变的原因。【结论】成功获得了人PCSK9 基因D374Y 突变体的克隆猪；与野生型猪肝脏相比，克 隆猪肝脏中LDLR水平显著降低，并且克隆猪肝脏发生了明显病变。 关键词：D374Y 突变体；体细胞核移植；五指山小型猪近交系；LDLR Production of Transgenic Pigs Over-Expressed PCSK9 D374Y Mutant ZHANG Xue, HUANG Lei, RUAN JinXue, LIU ZhiGuo, CHENG Ying, FENG ShuTang, MU YuLian, LI Kui (Institute of Animal Sciences of Chinese A