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[理学]第五章噬菌体载体和柯斯载体
第五章 噬菌体载体和柯斯载体 本章主要内容 噬菌体一般特性 λ噬菌体 柯斯质粒 M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒 二、噬菌体的感染性 噬菌体的感染过程 三、噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程: 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来 四、噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期:是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒,噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上,成为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期 整合:噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中 原噬菌体:在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体 超感染免疫性:溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。 2、溶源周期的主要特征 λ噬菌体和P1噬菌体 λ噬菌体的特征: (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后,需要合成一种整合酶,于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 (3) 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上,变成原噬菌体 (4) 细菌继续生长、增值,噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。 3、超感染免疫性 (1)溶源细菌的两个重要特点: 不能被头一次感染的噬菌体再次感染,称为超感染免疫性; 经过许多世代以后,溶源性细菌可以进入溶菌周期,称为溶源性诱发。 ① 超敏感免疫性 阻遏-操纵体系:cⅠ基因编码阻遏蛋白,启动子PL和PR,操纵基因OL和OR 五、重组噬菌体的分离 第二节 λ噬菌体载体 1、λ噬菌体特性及基因组结构 2、λ噬菌体载体类型及特点 cos位点的两个作用: 使进入细菌的DNA分子成为环状 ,这是插入细菌基因组的先决条件。 作为识别位点,由内切酶将滚环复制的多联体DNA切开 感染早期:从单一复制起点开始双向θ型复制,由O基因和P基因产物激活; 随后开始滚环复制,产生的线性DNA为基因组首尾串连的多联体DNA分子 ② 溶源化控制基因——att int xis Xis:控制一种蛋白质删除酶的合成 int:控制整合酶的合成 att:提供整合酶的识别位点 ③ 控制基因 cIII、N、cI、cro、cII ④ 溶菌基因——S、R Lac Z基因插入失活:如charon16A,λgt 11载体,在非必需区段引入lac Z基因,在lac Z基因上有EcoRⅠ位点,插入失活后利用X-gal法筛选(兰白筛选)。 在λNM781替换型载体中,可取代的EcoRⅠ片段,编码有一个supE基因(大肠杆菌突变体tRNA基因),这种λNM781噬菌体感染细胞后,寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制,因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。 如果这个具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了,那么所形成的重组体噬菌体,在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。 三、 λ噬菌体载体的改良 改良的目标: 扩大克隆容量 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体 构建可以方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体 发展可以使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆载体 1、Spi-正选择的λ噬菌体载体 λ1059、λL47.1 Spi-重组体的筛选 野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长,λ的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感) 但是当λ基因组中缺少参与重组的两个基因red和gam时,λ突变体可以在P2溶原菌中生长,其表型称为Spi-。 基因red和gam位于非必需区域内,外源DNA片段能置换基因red和gam形成重组体,其重组体不能在recA-的P2溶源菌中繁殖 可以在recA+的P2溶源菌中繁殖并且显示出Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶源菌作为宿主菌,就可以对重组体进行筛选。 λDNA的复制是由θ型向滚环型的转变,受到gam基因控制 基因gam功能:蛋白产物和寄主细胞的外切核酸酶Ⅴ(宿主recB和recC基因产物)结合成复合物,失去对λDNA的作用活性,因而λ噬菌体能够合成成熟的多联体DNA,供作包装底物 基因red功能:参与裂解性生长早期发生的重组反应,是核酸外切酶,使θ型复制中的病毒DNA分离形成子代闭环DNA分子 recA+的P2溶原菌 red-gam-:利用大肠杆菌的重组酶(recA+),通过单体λDNA间的
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