[医学]第六章 中药含量测定方法.ppt

第六章 中药含量测定方法 一、薄层色谱法 1、概述 一）薄层色谱法的特点 设备简单，操作方便。 广泛地选用各流动相，比气相色谱灵活。 灵敏度较高 薄层色谱法适于分析小量样品 可以采用多种展开方式：如，双向展开，多次展开，分步展开，连续展开；分离原理是的物理化学原理，例如，吸附色谱，分配色谱，离于交换，薄层电泳，薄层等电聚焦。适于分析热不稳定，难挥发的样品。 （二）方法原理原理： 薄层色谱分离法是将固定相吸附剂均匀地涂在玻璃上制成薄层板，试样中的各组分在固定相和作为展开剂的流动相之间不断地发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的分配过程。不同物质上升的距离不一样而形成相互分开的斑点从而达到分离。 （三）固定相 （1）硅胶：微酸性极性固定相，适用于酸性、中性物质分离（可以制备成酸度不同或碱性硅胶扩大使用范围） （2）氧化铝：碱性极性固定相，适用于碱性、中性物质分离（可以制备成中性或酸性氧化铝扩大使用范围） （3）聚酰胺：含有酰胺基极性固定相，适用于酚类、醇类化合物的分离 （4）纤维素：含有羟基的极性固定相，适用于分离亲水性物质 根据制备方法不同，吸附剂又可以分为不同的活性，如：硅胶和氧化铝可以分为五级 2、薄层色谱-可见分光光度法 1）点样：条状，50~300ul 2）定位：对照的位置，区带的范围 紫外、荧光、碘蒸气、对照品定位、紫外扫描 3）捕集： 4）洗脱： 渗漉、多次浸出、加热温浸、索氏回流提取 荧光板应洗脱后再比色 5）显色及比色 显色剂用量 反应时间、反应温度 显色稳定性 空白试剂及固定相最好不显色 3、薄层色谱-紫外分光光度法 不需加显色剂 其他同薄层色谱-可见分光光度法 4、薄层色谱扫描法 扫描方式： 反射法：紫外光区 透射法：可见光区 波长选择方式： 单波长法 双波长法：消除背景干扰 注意事项 样品的前处理：溶剂提取 吸附剂的选择：散射系数 点样 光源的选择：钨灯、氘灯、汞灯、氙灯 展开剂的选择 显色剂的选择 双波长法扫描光束的选择：最大吸收和无吸收点波长 扫描方式的选择：线性扫描、锯凿形扫描 5、薄层色谱-发光分析法 胶束增敏荧光法 ?-环糊精包含增敏作用 鲁米诺（Luminol)等化学发光体系 二、高效液相色谱 HPLC方法总结 七、色谱分离方法的选择 专业期刊： 《分析化学》 《色谱》 《分析科学学报》 《精细化工》 《分析测试学报》 《药物分析杂志》 《分析实验室》 《染料工业》 《理化检验－化学分册 》 《农药》 专业网站： 中国色谱网 — www.SeP 中国分析仪器网 — www.54PC.com 常用HPLC模式和仪器配置 模式 吸附 键合相 离子交换 尺寸排阻 疏水作用 亲和 色谱柱 C18 C8 Phenyl CN NH2 SiO2 -SO3H 泵 一元 二元 三元 四元 检测器 UV PDA FL RI EC ELSD MSD HPLC耗材的选用 色谱柱: C18 ，C8柱的通用性 无定型填料—柱效低，强度差，寿命短，价格低廉， 如 LiChrosorb RP18，YWG-C18 球形填料— 柱效较高，强度高，价格适中，如 LiChrospher C18，Spheresorb ODS，Kromasil C18 对称性填料—柱效高，峰形对称，价格较高，如 Symmetry ODS， 新一代反相柱—100％水性流动相兼容，耐酸碱性强，价格昂贵，如 Prevail，Platimum 色谱柱的保养—装卸、冲洗、贮存 不同品牌、不同规格色谱柱的比较 3-NPA 4-NPA 正、反相键合相色谱的概念 正相键合相色谱— 键合相极性强，流动相极性弱，极性弱的物质先出峰 反相键合相色谱— 键合相极性弱，流动相极性强，极性强的物质先出峰 键合相极性中等，流动相极性相对于键合相极性的强弱决定键合相色谱的正、反相 反相色谱流动相的选用 纯度：有机溶剂—HPLC级；水—超纯水； 无机物—GR；表面活性剂—HPLC级 中性成分：甲醇-水、乙腈-水、四氢呋喃-水 酸—乙酸、三氟乙酸、磷酸、高氯酸、正离子对 碱—乙二胺、三乙胺、Na2CO3、(NH4)2CO3、负离子对 过滤：有机溶剂 0.5 mm，水性溶液 0.45 mm 脱气：超声波、氦气、在线脱气 某黄酮提取物的色谱图 Impurity 正相色谱流动相的选用 正己烷、庚烷、氯仿 重现性的重要性 通过有限次测定获取准确可靠的结果是企业的追求。 同一份样品溶液重复进样得到再现的谱图是HPLC分析的基本保障。 多次取样，重复测定得到再现的结果是HPLC分析的最终目标。 溶剂的选择 — 样品溶液的制备（10 ml) 流动相最好 流动相的