[生物学]多糖提取纯化以及结构解析.ppt

多糖提取、纯化及结构分析文献总结;糖类介绍;糖类介绍;糖类(Carbohydrates)物质是含多羟醛或多羟酮类化合物。主要由C、H、O组成，其分子式常用Cn(H2O)n来表示。;Content;糖的分类;糖类介绍;单糖、低聚糖 常用水或醇提取，然后用不同的有机溶剂萃取得到不同极性的化合物。 多糖 常用热水、稀碱或稀酸溶液进行提取。 （植物体内苷常与水解酶共存，所以要杀酶或抑制酶的活性。）;;热水提取;除杂;糖类介绍; 纯化方法;由于不同相对分子质量的多糖在不同浓度的低级醇或低级酮中溶解性不同，可以逐步提高溶液中醇或酮的浓度以使不同组分的多糖依相对分子质量由大到小的顺序沉淀，最终达到分离的目的。;利用不同多糖与金属离子成盐后在水溶液中的特异性沉淀作用，用硫酸铵、乙酸钾、氯化钾等盐析剂，将不同的多糖逐步析出。;长链季铵盐是碱性表面活性剂，酸性多糖在溶液中以聚阴离子形式存在，它就与季铵盐或其碱形成不溶性配合物沉淀，又由于多糖分子酸性越强、相对分子质量越大越易沉淀出来，这样控制 季铵盐浓度即可以分理出不同的酸性多糖; 它利用的是不同多糖浓度乙醇中溶解性不同，先用4倍V的乙醇将多糖混合液沉淀在惰性的多孔纤维素柱上，再用不同浓度的乙醇洗脱，使不同多糖分离开来。;多糖分子带有电荷，可以 与离子交换剂中的离子或基团结合，亲和力随多糖结构与电离性的不同而不同，一般随分子中酸性基团的增加而增强，支链多糖比支链的更易吸附，然后用不同浓度的盐溶液进行洗脱。; 分子筛原理，按照分子量的大小不同进行分离。 常用葡聚糖凝胶（sephadex G）;常用的脱色方法;黏多糖（又叫酸性黏多糖）是一类广泛存在于动物体内的含糖醛酸和氨基糖残基的复合多糖，这是一类较有发展潜力的新型生化药物或生物制品。 提取： 黏多糖大多与蛋白质共价结合，首先常用酶降解部分蛋白或用碱使多糖-蛋白质间的键断裂，促进提取时的溶解。然后用普通蛋白沉淀法沉淀蛋白。 2）分离： ①有机溶剂分离法 利用不同浓度的乙醇依次沉淀不同的黏多糖。 ②季铵化合物沉淀法 其含有酸性基团，与表面活性剂形成季铵配合物，然后用不同盐离子浓度解离。 ③离子交换层析法 用阴离子交换剂交换吸附，再用NaCl溶液进行梯度洗脱;糖类介绍;;概念： 多糖由多个单糖以糖苷键相连而成的高分子聚合物。 方向：左：非还原端； 右：还原端。 ;多糖的结构： 一级结构：①单糖的组成； ②糖苷键的类型； ③单糖的排列顺序。 二级结构：取决于一级结构，指其分子骨架。;多糖的种类：1）均一多糖(同多糖)：由一种单糖缩合而成。;不均一多糖(杂多糖)：由不同类型单糖缩合而成;一：分子量及分子式的确定 质谱分析测定分子量和分子式。 苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易于分解，采用电子轰击质谱(EI—MS)常常不能获得分子离子峰。 现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法。;组成苷的苷元和单糖的鉴定 一般是将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，经显色后用薄层扫描法求得各种糖的分子比。 用GC或HPLC对单糖定性定量，GC常以甘露醇或肌醇为内 标，用已知单糖作为对照品。 NMR谱，也可以有效地鉴定苷分子中糖的种类。;苷元和糖之间连接位置的确定 13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。 成苷后，α-C约+8ppm,β-C约-4ppm 二维核磁共振谱(如HMQC COSY及HMBC谱)等技术广泛用于确定连糖位置。;糖与糖的连接位置的确定 全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇解产物。 甲基化法虽然不能解决多糖中单糖的连接顺序，但它对于阐明单糖的连接方式(键构型)、重复结构中某种单糖的数目、末端糖的性质以及分支点的位置等非常有用。;采用的方法通常是将这些甲基化的单糖进行了TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联用仪对其进行鉴定的报道。 全甲基化甲醇解：;苷键构型的确定 酶水解 转化糖酶--------水解β-果糖苷键 麦芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷键 杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷键,专属性较低 纤维素酶--------水解β