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探索噬菌体展示肽在促进药物透过生理屏障中的应用 　　　 　 　　摘 要：本文阐述了噬菌体展示肽在促进药物透过皮肤、血脑等生理屏障方面的研究应用及其展望。 关键词：噬菌体展示技术；肽；皮肤屏障；血脑屏障 药物须经从用药部位吸收进入血液循环，随血液分布到机体各组织中，才能发挥药理作用。而人体存在不同的生理屏障，如皮肤屏障、血脑屏障等，它们是机体重要的保护系统，可以阻止病原体、毒物和抗原的入侵，但也是限制药物吸收分布的主要因素，导致许多药物生物利用度低。因此基于对生理屏障的充分认识，根据药物的不同特性，采取相应的促吸收方法，具有十分重要的意义。 　　噬菌体展示技术（Phage Display Techniques）是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面形成噬菌体文库，噬菌体的遗传物质编码这些多肽或蛋白质的氨基酸残基，从而使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。通过体内或体外平板上进行的淘选过程，可以快速地找到与某种器官、组织或靶分子（如抗体、酶、细胞表面受体蛋白等）有特异性相互作用的肽或蛋白质。很多研究者利用体内噬菌体展示技术来筛选细胞结合肽，细胞穿透肽，器官与组织定位肽，穿透肠黏膜屏障肽[3]等。这一研究思路进一步应用到寻找能携带药物穿透皮肤、血脑屏障等生理屏障的肽方面，并取得了令人惊叹的结果，本文就这一方向的研究综述如下。 　　 　　1. 噬菌体展示肽促进药物透过皮肤屏障 　　 　　皮肤对大多数药物是一道难以通透的屏障，受到分子量（＜500Da）、亲脂亲水性和剂量（几毫克）的限制，许多药物透皮给药后达不到治疗要求，所以，寻找促进药物透过皮肤的方法是研究透皮给药系统的关键。但是现有促透技术均有自身的缺点和局限性，比如化学促透技术：不能有效的输运大分子亲水性药物如多肽、蛋白质等，容易导致皮肤损伤、发炎、过敏等；物理学促透技术需要特别的仪器，成本高，剂型灵活性差，不适合家庭的普遍使用等[4]。 　　陈勇平等创造性的利用体内噬菌体展示技术获得了一种短肽TD-1（ACSSSPSKHCG），此短肽能有效促进蛋白质类药物透过完整皮肤，并对其促透机理进行了探索研究[5]。 　　 　　1.1 通过噬菌体文库筛选透皮肽将噬菌体文库 Ph.D.-C7C 涂抹于BALB/cA 裸鼠腹部皮肤，然后从血液中回收噬菌体。 　　再进行扩增后应用于小鼠腹部皮肤，扩增后的噬菌体展示了比第一轮高两个数量级的透皮效率。如此两轮后挑12 单克隆进行测序，发现有8 个噬菌体颗粒含有相同的序列CSSSPSKHC，将该噬菌体命名为PH-1，PH-1 噬菌体具有穿透皮肤的特异性。进一步测序合成了短肽TD-1（ACSSSPSKHCG）。TD-1 对PH-1 噬菌体透皮效应具有明显地抑制，并且具有剂量效应，而随机肽AP-1 没有抑制效果。进一步说明PH-1 噬菌体之所以能够穿透皮肤屏障是TD-1 肽在发挥作用。并发现TD-1 对对照噬菌体SC 的透皮反而增强20%。由于噬菌体衣壳是蛋白质，提示TD-1 可能促进蛋白药物穿透皮肤。 　　 　　1.2 TD-1 对胰岛素透皮的影响选择胰岛素（Insulin，INS）为模型药物进行研究。建立链佐霉素诱导的Ⅰ型大鼠糖尿病模型，并对大鼠进行不同的药物组合（500μg TD-1+70μg INS、500μg AP-1+70μg INS、0.5% SLA/PP+70μg INS、70μg INS、14μg INS 皮下注射）处理采用放免检测血糖与血清胰岛素变化。TD-1+INS 组，涂抹腹部皮肤2h 后INS 开始上升（0.66~1.18ng/ml），5h INS 上升达峰值（2.85~4.76ng/ml），11h 左右回到基础值（0.37~0.81 ng/ml），相应地2h 后血糖开始降低，8h 血糖水平降到最低并能维持至11 h。而对照组（TD-1、INS、SLA/PP、AP-1+INS）血糖与INS 几乎没有变化。INS 皮下注射组出现一短暂及持续比较短的INS 上升及降血糖效应，峰值出现在2~3h 且持续不超过5h。结果显示INS 本身不能透过皮肤，但INS 与TD-1在生理盐水中简单混合即能促进INS 透皮，而产生降糖效果。 　　 　　1.3 TD-1 携带胰岛素透皮的特性 　　 　　1.3.1 剂量依赖性进一步研究证实 TD-1 携带外源INS 透过皮肤时具有TD-1 剂量效应与胰岛素剂量效应，500μg TD-1+70μg INS 应用于糖尿病大鼠腹部皮肤5h 后能使血糖显著下降（27.5%~44.5%）。　　 　　1.3.2 序列特异性以 TD-1 序列为基础合成不同的TD-1 变种，与TD-1 携带INS 透皮功能比较，这些肽的活性比TD-1 减少了很多。如将TD-1（ACSSSPSKHCG）两侧的A