[医学]第3章 微生物细胞的破碎技术.pptVIP

2 细胞壁的组成和结构 2.1 细胞壁的组成和破碎阻力 2.2 细胞壁的结构 各种微生物细胞壁的结构与组成 3 微生物细胞的破碎技术 3.1细胞破碎机理图 3.1.1高压匀浆法 高压匀浆器 3.1.2 珠磨法 原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破碎，再由液珠分离器分开、排出。（这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。） 构件：微珠、冷却装置、搅拌浆、液珠分离器、物料进出口。见图 高速珠磨机 电声超声波发生器 细胞破碎主要方法 机械破碎法与非机械法比较 3.3 破碎方法的选择 3.3.1破碎方法选择原则 3.4破碎率的测定 4. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 作业（1－4章） 1.以发酵液为例，简述生化分离的一般工艺流程 2.发酵液预处理的目的和方法 3.凝聚和絮凝 4.助虑剂与错流过滤 5.常见细胞破碎的方法及特点 细胞的数量 破碎条件——目标产物对破碎条件的敏感性 破碎目标——待破碎细胞的机械强度 (1) 目标生化物质的位置： (2) 目标生化物质对破碎条件的敏感性： (3) 破碎程度、目的 (4) 规模、经济 1.直接测定法－平板计数 2.间接法－测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率 4.1什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的不溶的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。（包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和RNA聚合酶。） 4.2包含体形成的原因 蛋白质的多肽链折叠成立体结构的过程中受周围环境的影响，分子间的相互作用影响到分子内的折叠。 a.由于表达的外源蛋白缺少某些折叠的协助因子或局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键。 b.表达率过高，合成速度太快，无足够的时间折叠，二硫键不能正确配对，过多的蛋白质间非特异性结合，导致溶解度降低。 c.重组蛋白氨基酸组成－硫氨基酸越多越易形成包含体。 d.重组蛋白质是E.coli异源蛋白，大量生成后，缺乏修饰所需要的酶和辅助因子，致使中间体大量累积，异形成包含体。 E.蛋白质的自身溶解性 特点 a.稳定性好 b.表达量高 c.杂蛋白少 e.对机械搅拌和超声破碎不敏感，易破碎 包含体分离的工艺路线 收集菌体 细胞破碎 离心分离 洗涤 除变性剂复性 变性溶解 1.破碎 2.洗涤－尿素、Triton-100 3.变性溶解－SDS、尿素、盐酸胍、DDT、2－ME 4.复性 a.定义：变性包含体蛋白在适当条件下使伸展肽链形成特定三维结构，使无活性分子成为具有特定生物学功能的蛋白质。 b.方法 透析法－去除变性剂、还原剂（小样品） 稀释法－水、缓冲溶液改变分子周围溶剂性质（大样品） * * 1.1目的物位置 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身：单细胞蛋白（SCP） 胞内产品: 胞内酶，基因工程产物等 1.2 细胞的破碎定义 用物理、化学、酶或机械的方法破坏细胞壁或细胞膜。 1.3 细胞壁特点 a.保护细胞 b.调节、控制代谢 c.抗机械撞击 第3章 微生物细胞的破碎 1. 微生物细胞的破碎技术概述 1.细胞壁的组成和破碎阻力 2.细胞壁的结构 2.1.1细菌：肽聚糖，蛋白质，磷壁酸，糖，脂；主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。 2.1.2酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，脂；主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。 2.1.3丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 back 细菌的细胞壁 酵母菌的细胞壁 丝状真菌的细胞壁 back next back 2.2.1细菌细胞壁的组成a：肽聚糖b：氨基酸：D-丙氨酸， D-谷氨酸，L-丙氨酸， L-赖氨酸c：磷壁质：糖醛磷酸酯的聚合物－革兰氏阳性菌d：糖e：脂质－革兰氏阴性菌2.2.2 革兰氏阳性菌a.15－50层肽聚糖片层b.壁磷壁酸和膜磷壁酸2.2.3革兰氏阴性菌 a.1－2层肽聚糖片层b.脂蛋白（将外膜固定于肽聚糖层）、脂质双层及脂多糖（稳定细胞结构） back 酵母菌的细胞壁 back 丝状真菌的细胞壁 高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境释放出来。 构造：高压位移泵、针形阀 影响因素： a. T b.操作压力 影响因素： ⑴搅拌速度 －适中 ⑵细胞浓度－最佳 ⑶珠粒的大小、用量