细胞培养与染色体技术教案.doc

细胞生物学技术 (细胞培养) 实验课主要内容 细胞培养总论 细胞培养实验准备 胎鼠大脑皮层神经元培养 细胞株传代培养 细胞计数 MTT法检测细胞活力 细胞的分裂指数 细胞冻存 细胞复苏 FCM法测定细胞周期 真核细胞转染 实验一 细胞培养总论 介绍细胞培养的定义 细胞培养（cell culture）是在体外（in vitro）模拟体内（in vivo）生理环境使从体内取出的细胞生存、生长繁殖的技术方法。 广义的体外培养包括三个层次：细胞培养、组织培养、器官培养，本课程主要介绍细胞培养。 细胞培养现已成为一种各学科广泛采用的实验技术，利用细胞培养法建立的各种细胞系（cell line）和细胞株（cell strain）达万种以上。 介绍细胞系（cell line）和细胞株（cell strain）的概念区别 （二）介绍细胞培养的发展简史 细胞培养技术已有百年历史， 1907年，悬滴培养标志着细胞培养的开始 二十世纪40年代始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培养。培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基（或称限定培养基）；促细胞生长物质从胎汁改用动物血清。与此同时，培养技术方法的革新进展也非常迅速。 二十世纪50年代起， 培养操作技术方法、培养容器和培养液三个方面得到很大改进，在卡氏瓶原理的启示下，出现了用试管培养，并设计出多种类型的培养瓶。 1957年Dulbecco 等采用胰蛋白酶消化，获得了单层（细胞〕培养（single layer culture），单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。此后单层培养便成了组织培养普遍应用的技术。用单层培养法得以建立了很多细胞系（cell Line）。 1948年 Sanford创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗传性状相同的克隆细胞株（clone或ce11 Strain）。 1951年Pomerat设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于做显微摄电影和细胞代谢等研究。 自二十世纪50年代末，组织培养技术的应用进入了一个繁盛的阶段。生物科学和技术科学相互渗透、遗传学和生物化学相互结合的结果，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学。这些新科学的形成和发展都与组织培养有密切关系。 当前，组织培养技术已广泛用于生物学和医学研究各个领域。而且通过应用又促进了组织培养技术的发展。出现了用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物、癌基因转染和细胞转化等各种新技术。 组织培养技术不仅是用于研究生命科学理论的重要技术方法，也日益成为生物工程和基因工程的生产手段。如新的中空纤维培养法一次可培养细胞1.2×1011个，能用于生产多种生物制品。 近年来，供细胞培养用的各种条件，如瓶皿、培养基和血清等都已商品化和系列化，使细胞培养工作方便可行。低温冷冻技术把已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存起来，并建立了统一冻存细胞的细胞库或中心，如美国的ATCC（American Tissue Culture Collection）；HGMR（Human Genetic Mutant Repository），CAR（Cell Aging Repository）等。在英国和日本等也有类似的机构。我国在上海和昆明也建立了小规模储存细胞的实验室。现在全世界储存细胞的数量已难以计算。这些设施为开展组织培养技术和应用培养细胞进行研究工作提供了极大的方便。 （三）介绍培养细胞的特点 细胞培养不仅是一种技术，也是一种科学，被用于培养的细胞或组织是非常好的实验对象，具有很多优点，但也有些不足。 优点： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。 便于使用摄影、摄像和闭路电视等方法进行记录，能直接观察活细胞变化。 可供研究的细胞种类极其广泛，从低等生物到高等动物以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可用于培养。 便于使用各种不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等方法观察和研究细胞。 培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组（Genome），也是分子生物学和基因工程学的研究对象；细胞培养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分。 易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究。 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。 已成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。 缺点: 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，即使当前模拟体内技术发展很快，但与体内环境相比，仍有很大差异。因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，不应把实验结果外推至体内，而轻易做出与体内等同的结论。