细胞组织培养及培养基的成分及制备2003.docVIP

化学名：2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid 中文名：羟乙基哌嗪乙硫磺酸 分子式：C8H18N2O4S HEPES是一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力。其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值.在这种培养条件下, HYPERLINK /special/experiment/cellculture.htm 细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中.大多数培养液中含有酚红作为pH指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色.HEPES有些昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒. 原则上,HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制.实际操作中并非如此简单. 溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长也是很重要的。 HEPES使用方法有两种： (1)HEPES可按所需的浓度直接加入到配制的培养液中,再过滤除菌.每1000ml培养液中加入2.38克HEPES,待溶后用lN NaOH 调pH至7.2,滤过除菌后使用.此时HEPES的使用浓度为10 mmol/L. (2)亦可配成 100 x 贮存液（l mol/L），使用前取 99ml培养液加入 lml贮存液，最终应用浓度仍为10mmol/L。l mol/L（100 x）HEPES贮存液配制方法:取23.8g HEPES溶于90ml双蒸水中,用lN NaOH调pH至7.5一8.0,然后用水定容至100ml,过滤除菌,分装小瓶（2ml/瓶）,4℃或-20℃保存. 掌握一般培养基制备的原则和要求。 2．熟悉一般培养基制备的过程。 操作步骤 一、培养基的制备原则和要求 培养基是根据各类微生物生长繁殖的需要，用人工方法把多种物质混合而成的营养物。一般用来分离、培养菌类。常用的培养基有基础培养基、增菌培养基、选择培养基、鉴别培养基和厌氧培养基。在制备培养基时，应掌握如下原则和要求： （一）培养基必须含有细菌生长繁殖所需要的营养物质。所用的化学药品必须纯净，称取的份量务必准确。 （二）培养基的酸碱度应符合细菌生长要求。按各种培养基要求准确测定调节pH值。多数细菌生长的适宜pH值为7.2～7.6，呈弱碱性。 （三）培养基的灭菌时间和温度，应按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果及不损失培养基的必需营养成分。培养基经灭菌后，必须置37℃温箱中培养24小时，???菌生长者方可应用。 （四）所用器皿须洁净，忌用铁或钢质器皿，要求没有抑制细菌生长的物质存在。 （五）制成的培养基应该是透明的，以便观察细菌生长性状以及其他代谢活动所产生的变化。 二、培养基制备过程 不同的培养基其制备方法也不同，一般包括以下步骤： （一）准确称量试剂??根据不同的菌类和用途，选择适宜的培养基，培养基所需试剂必须纯净。 （二）校正pH值??将称量好的培养基各种成分放入容器内，标记划线，加热溶解，补充水分，测定酸碱度，常用pH6.8～8.0的精密试纸或酸度计测定。用1N?NaOH和1N?HCl调节pH值到适宜范围内。 （三）过滤??将玻璃漏斗置铁架上，再用纱布夹棉花或用滤纸放在漏斗中，将上述培养基倒入其中过滤至透明。 （四）分装??将过滤后的培养基分装于中试管或三角瓶内（试管内每支装5mL；三角瓶中装100～150ml），塞好棉塞用牛皮纸包扎好，准备灭菌。 （五）灭菌??培养基的灭菌，常用高压蒸汽灭菌法。一般微生物的营养细胞在水中煮沸后即被杀死，但细菌的芽胞有较强的抗热性，须经高压蒸汽灭菌才能达到彻底灭菌的目的。根据蒸汽温度随压力升高而上升的原理，即压力越大，蒸汽温度就越高。因此，在同一温度条件下，采用高压蒸汽灭菌比干热灭菌法效果要好。而且在湿热情况下，菌体吸收水分后，其蛋白质易于凝固变性，因为蒸汽的穿透力强，杀菌效果好。 高压蒸汽灭菌，一般采用15磅／平方（即1.05kg／cm2）压力，此时的温度是121.3℃。灭菌20～30分钟后，可达到完全灭菌的目的。在进行灭菌的时候，首先要把灭菌锅内的冷空气排出，否则，冷空气存在会降低锅内的实际温度，影响灭菌效果。 三、基础培养基的制备 （一）牛肉浸液（肉水） 1．成分??新鲜牛肉?500g?，水1000?ml。 2．制法 （1）取新鲜牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小块，用绞肉机绞碎。 （2）按上述比例加水，浸泡过夜（夏天应将浸泡液放置在低温的地方，防止腐败；如果没有冷藏条件时，可省去浸泡过夜这一步），其间应搅拌数次。 （3）次日取上液煮沸一小时，并不断搅拌。 （4）补足蒸发的水分，用白布或绒布过滤后分装于三角瓶中，准备灭菌。 （5）置高压灭菌器内