第三章 植物细胞培养.ppt

植物细胞培养  第一节 植物细胞培养 (Plant cell culture）  指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或小细胞团）进行培养，形成单细胞无性系或再生植株的技术。Haberlandt（1902）首次尝试分离和培养植物叶片单细胞。 细胞培养的意义 有利于进行细胞生理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。 进行细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微生物遗传技术用于高等植物以进行农作物的改良。 细胞培养的增殖速度快，适合大规模悬浮培养，生产一些特有的产物，如许多种植物的次生代谢产物，包括各种药材的有效成分等，用于医药业、酶工业及天然色素工业，这是植物产品工业化生产的新途径。 由于植物组织培养中细胞之间在遗传和生理生化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出一定的差异。这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病虫和抗逆性等方面。所以由单细胞培养获得的单细胞无性繁殖系，并对不同的细胞进行研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。 细胞培养就是从高等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进行培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。 植物细胞培养 第一节 植物细胞培养 第二节 细胞生长和活力的测定 第三节 人工种子 一. 单细胞培养（一）单细胞分离 1. 机械法 2. 酶解法 3. 从愈伤组织中分离 (二) 单细胞的培养方法 平板培养（细胞的生长周期） 看护培养 微室培养 4. 条件化培养 一、单细胞培养 （一）单细胞的分离 1.机械法: Ball(1965)首次由花生成熟叶片利用机械的方法使叶肉细胞得到分离的技术。 ⑴ 刀片刮: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表皮(露出叶肉细胞) →用解剖刀刮下细胞→单细胞悬浮培养 ⑵ 研磨离心法: 取下叶片→叶片消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶片+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离心(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养 研磨介质: 20?mol蔗糖+ 10?mol MgCl2 + 20?mol Tris-HCl (pH7.8) 机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发生质壁分离。 （缺点）（3）材料要求是薄壁细胞、组织排列松散。（4）产量低 2. 酶解法 利用果胶酶使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞的技术。 Takebe等(1968) 以烟草叶片为材料： 过程：叶片消毒→撕去下表皮→切成小方块(约4cm)→加酶液(2g叶片+20ml无菌酶液)→真空抽气→ 25℃振荡酶解2h (每30min换酶液1次,共4次)→ ①弃掉 ②海绵簿壁细胞 ③、④叶肉栅栏细胞 酶液组成：含0.5%果胶酶，0.8%甘露醇和1%硫酸葡聚糖钾（是原生质膜的稳定剂，以降低酶液中核糖核酸酶活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞产量） 酶解法的特点：能得到比较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在使用该法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。 3.由培养的愈伤组织中分离单细胞 首先通过固体培养诱导外植体脱分化,把未分化和疏散的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶内，将这些悬浮培养物在摇床上进行振荡培养，并得到游离细胞。 振荡的作用： （1） 对细胞团施加一定的缓和压力，使之破碎成小细胞团或单细胞。 （2） 振荡可使细胞或细胞团在培养基中均匀分布。 （3） 促进培养基和容器内气体交换，保证细胞正常的呼吸代谢。 一. 单细胞培养（一）单细胞分离 1. 机械法 2. 酶解法 3. 从愈伤组织中分离 (二) 单细胞的培养方法 平板培养（细胞的生长周期） 看护培养 微室培养 4. 条件化培养 1.平板培养法（plate cultivation method） 是将悬浮培养的细胞接种到薄层培养基上进行培养的过程，是常用的单细胞培养法。 单细胞的获得： 先将含有游离细胞和细胞团的悬浮培养物过滤除去较大的细胞团，留下游离的单细胞和小细胞团，从而得到单细胞无性系。 细胞记数： 过滤的悬浮培养材料先进行细胞计数，使悬浮培养液达到要求的细胞培养密度。烟草细胞培养的最适密度0.5-1.0×104/ml。