人MGC5306基因原核、真核表达载体的构建.pptVIP

潘聪 雷鸣教授 陕西省农业分子生物学重点实验室第六工作室 陕西 杨凌 2008.12.22. 目录 研究背景 研究内容及技术路线 实验结果及小结 展望 一、研究背景 1.MGC5306的研究进展 2004年，Liming Wang等报道为了寻找潜在与polβ相互作用的蛋白时发现一种新的酵母双杂交克隆。该克隆的表达序列与homo sapiens蛋白MGC（mammalian gene collection）5306相同，且主要在卵巢癌组织中表达。Liming Wang等将293细胞MGC5306cDNA克隆到EGFP-N1表达载体中。构建的重组子转染293细胞，与polβ在细胞核内共定位。 MGC5306的基因结构 MGC5306（Genebank NM_024116）定位于染色体11q21，编码278个氨基酸。 MGC5306 N－端是一个丝氨酸富集区，和两个酸性区（184－192和200－216）。在MGC5306基因序列N－端区域（AA92-108）发现有一个典型的双向的核定位序列，提示MGC5306蛋白在细胞核内核转运中可能发挥着作用。 2. MGC5306与其他蛋白的相互作用 MGC5306是人SL1蛋白的一个亚基。 EGFP-MGC5306在polⅠ发生转录的核内过量表达，染色体免疫分析MGC5306与SL1另一个亚基（TBP）聚集在rRNA启动子区，说明MGC5306是polⅠ转录过程中SL1的一个组成成分，为功能性SL1所必需，并在polⅠ转录过程中发挥作用。 Julia J Gorski等从Hela细胞核提取物中纯化SL1蛋白，肝素亲和层析柱进行盐梯度洗脱得到的片段，进行2D凝胶电泳分离蛋白，发现MGC5306的去磷酸化使MGC5306电泳移动性提高，说明MGC5306是一个磷酸化蛋白。 3.MGC5306的生物学功能 Julia J Gorski等研究发现SiRNA转染HEK293细胞使mRNA水平下降，蛋白表达下降（25％）,特异的减弱SL1的功能，表明了MGC5306在SL1功能发挥中具有一定的作用。 Liming Wang等还发现SiRNAMGC5306调节细胞的生长和存活并影响细胞周期。转染0～100nmol.L－1 SiRNAMGC5306 48h，细胞数随着SiRNA浓度的升高逐渐降低，在100nmol.L－1时，约70％的细胞生长受到抑制，并且，与未转染细胞比较，细胞存活率降低50％。说明SiRNA介导的MGC5306表达沉默抑制细胞的生长，从而起到抑制细胞存活的作用。 Liming Wang用流式细胞仪检测细胞周期检测SiRNA在细胞阻滞和刺激凋亡中的作用。 发现MGC5306表达下调诱导细胞凋亡和细胞分裂的S期阻滞，表明MGC5306在S期DNA合成中发挥着某种作用。 4.MGC5306在肿瘤发生中的潜在作用 在9例卵巢癌组织中有6例检测到了MGC5306的表达，而在正常卵巢组织中没有检测到。表明MGC5306在卵巢癌组织过表达。另外MGC5306在8例卵巢交界性囊腺瘤(low malignant potential ovarian tumors)中不表达。我们可以将MGC5306的表达作为卵巢癌的诊断的分子标记和鉴别卵巢癌由良性转为恶性的手段。 通过RNAi技术和构建真核表达载体改变MCF-7细胞中MGC5306的表达水平，利用western blot的方法观察了细胞周期调控蛋白p53以及其通路上的相关蛋白MDM2, p21的表达变化，发现MGC5306可以激活MDM2的表达，从而抑制p53和p21蛋白的表达水平，最终影响细胞的生长变化，证明MGC5306对细胞的生长促进作用是p53依赖的。 5.SUMO化修饰 SUMO化修饰是指一种类泛素化修饰，是SUMO共价结合于靶蛋白的赖氨酸残基上，SUMO化修饰参与了更为广泛的细胞内代谢途径，在蛋白之间的相互作用、信号转导、核质运输、转录调控等方面均发挥着重要的作用。 SUMO化过程由以下几个步骤完成：1成熟：SUMO 前体蛋白在蛋白酶(Ulp) 的作用下成熟，暴露出C 端Gly；2激活：SUMO的C 端Gly通过水解ATP 提供能量与E1 (Aos1/ Uba2) 的一个Cys残基通过硫酯键相连接；3 缀合：激活的SUMO经E1传递到E2 (Ubc9)，与Ubc9活性位点的Cys93残基借助硫酯键相连接；4连结：SUMO的Gly与靶蛋白Lys 残基的ε2氨基通过异肽键结合；5通过异肽键酶的作用，SUMO与靶蛋白分离，回到初始状态，称为去SUMO化(desumoylation)。 二、实验内容及技术路线 1