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蛋白质化学 第3章 氨基酸 What do proteins do? 蛋白质工程 重组DNA技术基础上发展起来的蛋白质工程 定义：通过蛋白质化学，蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于蛋白质物理，化学等各方面的信息，在此基础上对编码该蛋白质的基因进行有目的的设计改造，并通过基因工程等手段将其表达和分离纯化，最终将其投入实际应用。 蛋白质的元素组成 蛋白质一般含碳50％~55%、氢6％~8％，氧20％~23％，氮15%~18%，硫0%～4%。 有些蛋白质还含有微量的磷、铁、锌、铜、钼、碘等元素。 其中氮的含量在各种蛋白质中都比较接近，平均为16%。 每1g氮相当于6.25g的蛋白质 肽和蛋白质的全水解方法 1、酸法：6mol/L HCI于110℃、真空条件下水解10~20hr。 缺点：破坏了色氨酸 优点：不消旋 2、碱法：用5mol/L NaOH于110℃、真空下水解20hr左右。 缺点：多种其它氨基酸遭破坏，得到的是各种氨基酸的消旋混合物。 优点：不破坏色氨酸。 3、酶法： 一、氨基酸的通式 组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种 （1）非极性R基氨基酸 八种：Ala、Val、Leu、Ile Phe、Trp Met、Pro 3、带正电荷的R基氨基酸 （3）带正电荷的R基氨基酸： Lys、Arg、His在pH7时带净正电荷 His：在pH6.0时，his的R基50%以上质子化，但pH7.0时，质子化的分子不到10%。 His是R基的pK值在7附近的唯一的氨基酸 附：不常见的蛋白质氨基酸 存在于少数蛋白质中特有的氨基酸，是在蛋白质生物合成后由相应的基本氨基酸衍生来的。 N-甲基赖氨酸存在于肌球蛋白中 γ -羧基谷氨酸存在于凝血酶原中 锁链素：由4个赖氨酸形成的衍生物存在于弹性蛋白质中 3,5-二碘酪氨酸和甲状腺素都是酪氨酸衍生物 3,5,3’,5’-四碘甲腺原氨酸 非蛋白质氨基酸 不是蛋白质的组成成分 以游离或结合的形式存在于生物界 大都是常见氨基酸的衍生物 还有些是β-,γ-,δ-, 和D-型氨基酸 一些是代谢中间产物，如瓜氨酸、鸟氨酸； γ-氨基丁酸等 第二节 氨基酸的理化性质 氨基酸等电点的计算 （二）分配柱层析 填充物为亲水性的不溶物质如纤维素、淀粉、硅胶等；固定相为水，流动相为有机溶剂。洗脱顺序：先极性小后极性大。 收集的组分用茚三酮 显色定量。 （五）离子交换层析 （六）高效液相层析HPLC 固定相支持剂颗粒细，表面积大； 采取高压，洗脱速度快。 分配层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤均可用HPLC P155: 5,6,7,14,15 固定相只能与一种组分结合， ——分开其它无亲和力的组分 亲和 离子交换剂 亲和性不同 离子交换 固体 吸附能力不同 凝胶 多孔凝胶 通过速度不同 液体 分配系数不同 分配 吸附 按层析原理分： 固定相 各组分对固定相 （三）纸层析 支持物为滤纸；固定相为水，流动相为有机溶剂。洗脱顺序：先极性小后极性大。 分离的组分用茚三酮 显色定量。 氨基酸的理化性质 （1）与甲醛反应 氨基酸在溶液中有如下平衡： 节首 若用碱滴定－NH3所释放的H＋来测定氨基酸，一般指示剂变色域小于10，很难准确指示滴定终点。 氨基酸的理化性质 甲醛滴定法 不仅用于测定氨基酸含量，也常 用来测定蛋白质水解程度。 节首 NaOH滴定 氨基酸的理化性质 （2）与亚硝酸反应 含游离α-氨基的氨基酸能与亚硝酸起反应，定量地放出氮气，氨基酸被氧化成羟酸。 含亚氨酸的脯氨酸则不能与亚硝酸反应。 节首 氨基酸的理化性质 测定N2 的体积，即可算出氨基酸的含量。Van Slyke （范斯来克法）氨基氮测定法就是根据此反应原理。 节首 N2中的1/2为氨基氮。 （3）与酰化试剂反应 用途：用于保护氨基以及肽链的氨基端测定等。 （4）羟基化反应 NO2 F O2N + H2N—CH—COOH R NO2 O2N HN—CH—COOH R + HF 弱碱性 二硝基苯基氨基酸DNP-氨基酸 （黄色，可用乙醚抽提） 2,4-二硝基氟苯(DNFB) （4）羟基化反应 桑格尔试剂 1945年由Sanger发明此法 多肽或蛋白质N端氨基酸的α-氨基也能与DNFB反应，生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。 Sanger等人对胰岛素一级结构的阐明就是应用了这一方法。 Sanger 法测定N末端氨基酸基础 —N=C=S + N—CH—COOH H H R PITC