[基础医学]原位杂交20120906.pptVIP

第五章 原位杂交组织化学 第一节 原位杂交组织化学基本原理 变性 变性温度（Tm） 复性 DNA变性(denaturation) 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 变性温度（melting temperature,Tm） 热变性使DNA分子双链解开所需温度称为熔解温度。 影响Tm的因素 DNA的均一性 DNA分子中的（G+C）含量 溶剂的性质 低离子强度，Tm低 高pH 变性剂甲酰胺 复性（renaturation） 指变性的DNA(单链)在适当的条件下，两条彼此分开的多核苷酸链又可以重新结合成双螺旋结构 复性的影响因素 温度 DNA浓度 DNA片段长度 DNA分子的复杂性 离子强度 第二节 核酸分子杂交 两条互补DNA或RNA单链之间以复性的原理形成双链核酸的过程 核酸分子杂交 液相杂交 固相杂交 原位杂交组织化学(ISH) 应用特定标记的已知核酸探针与组织或细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，杂交后的信号可以在光镜或电镜下进行观察。 可进行细胞内核酸定性、 定位的一种技术。 第三节 核酸分子探针 定义：一种带有标记物的、已知的、仅与靶分子特异反应的分子。 探针的种类 DNA探针 cRNA探针 寡核苷酸探针 DNA探针 基因组DNA探针 最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针 cDNA探针 互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的 优点：制备方法简便，不易降解，标记方法较成熟 cRNA探针 以cDNA为模板在体外转录而成的探针 优点 单链探针，故以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。 cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比cDNA-mRNA杂交体稳定．因此杂交反应后可经受高严格度洗涤。 cRNA-mRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。 缺点 制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件， cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作过程中需严格防止RNA酶污染。 寡核苷酸探针 根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段。 优点： 　　①短的探针比长探针杂交速度快，易穿透组织。 　　②制备简易，可以在短时间内大量制备，序列任定。 　　③在合成中进行标记制成探针。 　　④使用简便，可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。 　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。 　　 探针的标记 探针标记物 放射性同位素 3H 、35S或32P 易掺入，敏感，易检测，时间长，污染 非放射性标记物 稳定，分辨率高，时间短，操作简便，无污染 酶类：HRP,AKP 半抗原：生物素,地高辛，2，4-二硝基苯（DNP） 荧光素：FITC,罗丹明 探针标记方法 根据探针的标记物 是否能直接检测 直接法 间接法 第四节 原位杂交组织化学基本程序 标本制备 杂交前处理 杂交反应 杂交后处理 检测杂交信号 标本制备 取材 固定 固定剂 4％PFA 固定方法 切片 石蜡切片 冰冻切片 培养细胞 杂交前处理 增强组织通透性和核酸探针穿透性 去污剂处理 Triton X-100处理15min 蛋白酶处理 蛋白酶K ，37℃孵育15~30 min 减低背景染色 酸酐和稀酸处理 0.25%乙酸酐处理10 min 预杂交 不含探针的预杂交液在杂交温度下预先孵育标本1~2h 内源性生物素和酶的抑制 用5%脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液 对于内源性的AKP和过氧化物酶可通过将标本分别浸于20%乙酸(4℃)中15秒或过碘酸淋洗和用含1%H2O2的蒸馏水或甲醇溶液室温孵育30min加以阻断。 杂交反应 双链DNA探针和靶DNA变性 杂交反应进行时，探针和靶核酸必须是单链。 杂交液 探针 探针长度 50-100bp，最长不宜超过400个碱基。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 探针浓度 0.5-5.0μg/ml 。 甲酰胺可使Tm降低，可避免因杂交温度过高而引起的组织形态结构的破坏以及标本的脱落。 硫酸葡聚糖能与水结合，提高探针有效浓度。 牛血清白蛋白阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。 杂交温度和时间 大约在30~60℃之间。一般将杂交时间定为16~20h，或为了方便，将杂交液和标本孵育过夜 杂交后处理 杂交后处理主要包括系列不同