[工学]第二章：分子克隆的工具酶.ppt

mcrA, mcrBC, mrr 都限制由 CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA Mrr也限制m6A McrBC 切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间隔3kb，最适为55～103bp，需GTP 大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统 三个都不限制Dam, EcoKI , EcoRI修饰的位点 McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点 三、甲基化对限制酶切的影响 1. 修饰酶切位点 ① HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割 ② BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG 如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割 ③ 构建DNA文库时 用AluI(AG↓CT)和HaeIII(GG↓CC)部分消化基因组DNA 用M.EcoRI甲基化酶处理， 然后加上合成的EcoRI接头 当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割 2. 产生新酶切位点 TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI 3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG 肠道细胞的Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割 其它 4. 对基因组作图的影响 在哺乳动物DNA CpG序列出现的频率大约只有预计的1/5 含CpG序列的识别序列极其稀少 大多数CpG都发生甲基化 含CpG的所有识别序列的酶不能切割 CpG甲基化大多数不完全 对酶切位点稀少的酶来说 在其识别位点上的甲基化具可变性 第三节 DNA聚合酶 DNA polymerase 催化DNA的合成(模板/引物/dNTP等)及其相辅的活性 真核细胞有 4种 DNApoly ?：也许是复合物，位于细胞核内，有催化细胞增生的作用。 ?：小分子蛋白质（4.4kDa）曾从小牛胸腺出大是出，与细胞增生无关。 ?：100kDa，利用RNA为模板的效率比利用DNA为模板的效率高。 其它：线粒体DNA聚合酶、催化线粒体DNA的合成。 原核细胞三种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关 I．单链多肽，可催化单链或双链DNA的延长 II 与低分子脱氧核苷酸链的延长有关 III 在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶 I Ecoli DNA polymerase I 1. 活性 单链多肽(109kDa) 三种活性 ① 5’→3’DNA聚合酶活性 底物: 模板(ssDNA), 引物（带3‘OH基） 或 5’突出DsDNA Mg2+ dNTP DNApolyI ②5’→3’外切核酸酶活性 底物: dsDNA or DNA: RNA杂交体 活性：从5’端降解dsDNA，也降解 RNA:DNA中的RNA(RNase H 活性) Mg2+ DNApolyI + dNTP ③3’→5’外切酶活性 底物：3’-OH dsDNA or ssDNA 活性：从3’-OH端降解DNA，可被5’→3’聚合活性封闭。 Mg2+ DNApolyI + dNTP Mg2+ DNApolyI + dNTP Proof reading 反应平衡 过量dNTP 平端 2. 用途 ①切口平移法标记DNA Nick translation （所有DNApoly中只有此有此活性） Mg2+, 低限量DNase I dNTP DNApoly I 产生切口 切口平移外切活性和合成活性共同作用使切口沿5’--3’方向平移 若有放射性dNTP, 则可标记成探针 1. 产生的5’突出端补平后连接 EcoRI GAATTC CTTAAG ...CTCGAGGAATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAAGGACGTC... XhoI EcoRI Ps