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实验九 噬菌体的分离 何伟 06－04 实验目的 1、利用噬菌体的一些生物特性，从自然环境中分离、纯化大肠杆菌噬菌体，掌握噬菌体分离纯化的基本原理和方法。 2、在实验过程观察噬菌斑的形态，和细菌菌落进行对照加深印象。 3、绘出平版中噬菌斑的形态特征。 实验原理 噬菌体是专性寄生物，所以自然界凡是有细菌分布的地方，都可发现其特异的噬菌体存在。如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，固也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体 。噬菌体颗粒可以独立存活（当然不能生长）。 噬菌体存在的特征是使含有特定宿主的菌悬液由浑浊变清亮或者在有宿主细胞生长的琼脂平板上形成透明的或浑浊的空斑，称噬菌斑。 本实验是从阴沟污水中分离大肠杆菌噬菌体，刚分离出来的噬菌体常不纯，如表现在噬菌班的形态、大小不一致等，可再作进一步纯化。 实验器材 仪器设备： 500ml三角瓶、中试管、培养皿、无菌不锈钢涂布器、无菌吸管、无菌滤器（孔径0.22um）、恒温水浴锅、真空泵、恒温培养箱、灭菌锅、抽滤瓶等 试剂： 大肠杆菌、三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨液体培养基、含琼脂0.7%、2%的半固体、固体培养基、阴沟污水、无菌水等 实验步骤 1．制备大肠杆菌菌悬液 37℃培养18小时的大肠 杆菌斜面一只，加无菌水5ml洗下菌苔，制成菌悬液。 2．增殖培养 把200ml污水加到有100ml三倍浓缩的牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶中，再加入2ml大肠杆菌菌悬液，37℃振荡培养24～48小时。 3．制备裂解液 将上述液体以5000r/min离心15min。 以无菌操作把无菌滤器安装于灭菌抽滤瓶上，正常过滤除菌。滤液37℃培养过夜，以作无菌检查。 4．确证实验 检查噬菌体是否真的存在（看大肠杆菌平板上能否长出噬菌斑） 5．噬菌体的纯化 （1） 把具有噬菌体的滤液接种一环于液体培养基内，再加入0.1ml大肠杆菌菌悬液，充分混合。 （2） 在固体琼脂平板上倒入5ml融化并冷却到48℃半固体培养基，加入（1）中混合液0.2ml，立即混匀，铺平，37℃正置培养24小时。（3） 取大肠杆菌的噬菌斑（中部）一环，接种于大肠杆菌培养液内，37℃培养，即可得到纯化的噬菌体。 6. 高效价噬菌体的制备 将纯化的噬菌体滤液与培养液1：10混合，再加入适量（与噬菌体滤液等量或1/2的量）的大肠杆菌菌悬液，培养增殖，重复数次，最后过滤，可得到高效价噬菌体的制品。 实验结果 绘出平板中噬菌斑的形态特征 * *