(生物化学实验)蛋白质定量分析.ppt

实验一 蛋白质的吸光分析测定 陈晓宁 xiaoningchen@fudan.edu.cn 实验时间 周次 日期 内容 上课时间 第2周 9月13日 蛋白质测定 周二4-9节 第6周 10月11日 酶促动力学 第8周 10月25日 蛋白电泳 第12周 11月22日 综合1 第14周 12月6日 综合2 目的： 原理：简要概述 方法：阐述实验过程 结果：原始数据+图表+结论 讨论：问题+自由讨论 实验报告格式 本次实验内容 利用分光光度计进行蛋白质定量测定 1.改良Lowry比色法（Hartree法） 2.考马斯亮蓝结合法(Bradford法） 3.紫外分光光度法 吸光分析法的原理 1.有色物质对可见光有选择性吸收作用；一些无色溶液对可见光无吸收作用，但其所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。 2.不同物质由于分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同。因此每种物质都具有其特征性的吸收光谱。 3.在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质的浓度成正比。 如何鉴定？— 利用吸收光谱鉴定化合物 利用分光光度计绘制吸收光谱曲线 用各种不同的单色光分别通过某一溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸收度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度-波长曲线，即吸收光谱曲线。 每种物质有其特征性的吸收光谱 胡萝卜素蛋白复合物室温吸收光谱 如何定量？—Lambert-Beer 定律 1. 朗伯（Lambert）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度增加呈指数减少。 LgI0/I=KL I0 :入射光强度； I :透射光强度；L ：介质厚度 K：吸光系数 2．比尔（Beer）定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度的增加呈指数减少。 LgI0/I=KC I0 :入射光强度； I :透射光强度；C ：介质浓度 K：吸光系数 3.Lambert-beer’s law的合并 一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 A= -lgT= -lg I/ I0=KCL A：吸光度； C：溶液浓度； L：液层厚度；T：透光度 K：即吸光系数，是指当溶液浓度为1mol/L,光程(溶液厚度)为1cm时的吸光度。 应用中注意的问题 ① Lambert-beer’s law的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，稀溶液能很好的服从该定律，A宜在0.05-1.0之间，超过该范围→偏离→计算结果与实际浓度不相符 ② 选择波长：最大吸收波长 a.灵敏；b.避免杂质干扰。 ③ 参比溶液（空白管）：消除背景效应，应包含除待测溶质以外所有的成分。 空白管 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。 测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收。 计算 （1）标准管法（标准比较法） 实际测定过程中，用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算。 A标准/A样品= K标准C标准/ K样品C样品 C样品=A样品/A标准×C标准 A：吸光度；K：吸光系数；C：溶液浓度；L：液层厚度 配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。 （2）标准曲线法 标准曲线使用注意事项 ①标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间。 ②吸光度在0.05-1.0范围内。 ③所作标准曲线仅供短期使用。 ④标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生。 分光光度计的使用 一．分光光度计基本部件 1．光源 分光光度计上常用的光源有两种，即钨灯和氘灯。在可见光区，近紫外光区和近红外光区常用钨灯；在紫外光区，多使用氘灯。 2．单色器 棱镜或光栅，把混合光分解为单一波长的光。 3．吸收池（比色皿、比色池） 选用合适的比色皿（可见光—玻璃；紫外光—石英；规格、新旧程度一致） 4．检测器 5．测量装置 分光光度法所使用的光谱范围： 200nm -- 10μm 200-400nm 400-760nm 760-10,000nm 紫外光区