血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义教材教学课件.ppt

G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 地高辛(Digoxigenin,DIG))一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质 ，由于洋地黄植物的花和叶片在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS) 生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常紧密,比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的荧光或者二抗检测。 蛋白质免疫分析—探针为抗体 2. 按样品制备过程划分 1） 原位杂交(in situ hybridization) i. 原位菌落杂交：DNA探针与菌落DNA的杂交。 ii. 原位噬菌斑杂交： DNA探针与噬菌斑DNA的杂交。 iii. 原位细胞杂交：cDNA与细胞中的RNA杂交 iv. 原位组织块杂交：DNA探针与染色体DNA杂交。 以上都是原位裂解细胞，不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。 2）斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。 3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization) 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。 最常用的几种固相支持物 ①硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可与三类大分子结合，但是不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000） ③ 尼龙膜 尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物．它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰，这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 (三)分子杂交的一般程序 1) DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品→与固定基质结合→80℃真空固定→预杂交→加入标记探针杂交→洗涤→放射自显影或显色反应。 2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品→与固定基质结合→常温空气中固定→封闭剂封闭→ 一抗反应→洗涤→二抗-酶偶联物反应→洗涤→显色反应（EIA） 或 → 一抗放射标记物→洗涤→放射自显影（RIA） （四） 常见几种核酸分子杂交技术 1）Southern blotting ：1975年由E.Southern首先设计出来的一种用于检测DNA样品中特异序列及其位置的技术。 2)Western blotting杂交 杂交对象是蛋白质，是通过抗原抗体的免疫反应，从混合样品中检测出特异的目的蛋白。 先将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开， 然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。 2 用待测目标蛋白的抗体（一抗）与固相膜上的蛋白质相互作用。 3 经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的第二抗与第一抗反应后的固相膜作用，如果一抗能与目标蛋白结合，则二抗可以和第一抗结合，那么二抗连接的标记酶与显色底物反应呈现颜色，从而可以确定固相膜上目标蛋白的位置及分子质量大小。 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备（定量） SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 封闭 脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 一抗、二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml