限制酶【精美生物医学课件】.pptVIP

看书找答案…… 1、核酸酶分哪两种，有什么差别？ 2、限制性核酸内切酶分几种，哪种最常用，为什么？ 3、DNA连接酶的作用是什么，哪两种较常用？ 4、大肠杆菌DNA聚合酶的种类和作用 限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶分为： 外切核酸酶【从一头开始，顺序切断】 内切核酸酶【能识别特定序列切断】 内切酶生理意义：分解外来DNA，保护自身DNA 三、DNA聚合酶 催化合成DNA的酶 特点：不能自行从头合成DNA链，必须有一个RNA引物 分类: 大肠杆菌DNA聚合酶 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶 2. E.coli pol Ⅰ的特点 1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性 在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其大片段称为Klenow片段, 具3’→5’外切酶活性 2） 聚合酶活性，5’→3’, 要求3’-OH引物和模板DNA 3） 外切酶活性 2. 用途 主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍 四、其它DNA修饰酶 磷酸酶和T4多聚核苷酸激酶 DNA酶Ⅰ（ DNase I） RNA酶（ RNase） 末端脱氧核苷酸转移酶（TDT） RNase RNase H 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二条链cDNA链的合成。 克隆位点【外源DNA进来的座位】 克隆位点就是限制酶的识别位点 【方便剪开载体，和外源DNA粘到一起】 3.必须具有用于选择克隆子的标记基因 （1）抗性标记基因：抗生素抗性、重金属抗性(Cur ，Znr )、代谢抗性(TK，抗除草剂基因) （2）营养标记基因:主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因 （3）生化标记基因(其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ) Ampr抗性基因编码一种β-内酰胺酶，可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 （一）质粒载体 大多是在天然松驰型质粒的基础上经人工改造拼接而成，是应用最广的载体。 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19 理想质粒载体应具备特点： 1. 松驰型复制子 复制子（replicon）是质粒自我增殖所必需 2. 几个单一的酶切位点（或多克隆位点） 以便目的DNA片段插入 一、质粒载体 3. 插入失活的筛选标记 一般应具有两种抗菌素抗性标志 如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基因（Tetr）等 4.分子量相对较小和较高的拷贝数 5.缺点：容量较小，一般只能接受小于15kb的DNA （一） pBR322质粒载体 pBR322载体是最早被广泛应用克隆的载体之一，至今尚在使用。 pBR322载体的组成： 复制起始位点（ori） Ampr Tetr pBR322质粒载体和特点 1. 带有一个复制起始点（ori） 2. 抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记 3. 数个单一的限制性酶切位点 当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amps）或Tet敏感（Tets），即插入失活 一、质粒载体 4. 较小的分子量 易于自身DNA的纯化，而且能有效地克隆6kb大 小的外源DNA片段。 5. 较高的拷贝数 经氯霉素扩增后，每个细胞达1000~3000个拷贝。 （二） pUC质粒载体系列 在pBR322基础上改建而成 典型的pUC质粒载体有4个组成部分： 来自pBR322 质粒的复制起始点 Ampr基因 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，称为LacZ′基因 位于LacZ′基因中靠近5′-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能 pUC系列的优越性 最通用的大肠杆菌克隆载体之一 优点 具有更小的分子量和更高的拷贝数 构建pUC系列时仅保留了pBR322的复制子和Ampr 具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ′基因，适应于组织化学筛选重组体 二、噬菌体和病毒载体 病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。 分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后 病毒载体： 一、Ca MV克