微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定和保藏实验方案设计1.ppt

微生物菌群的分离纯化、培养、鉴定及保藏 ——食品1201班 第六组 陈帆、刘旸、 荣跃、龙开友 实验目的和要求 实验原理 实验安排 1、 2、 3、 4、 实验材料和器材 实验方案内容 1 实验目的及要求 1.1 ?学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 1.2 掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 1.3 学习掌握菌种保藏的原理和方法。 2 实验原理 2.1 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 2.1.1 平板涂布法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 用途：一般多用于从菌种的纯化； 优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离； 缺点：不能计数 2.1.2 平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。? 优点：可以计数，可以观察菌落特征。? 缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。 2.2 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 2.3 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的。 3.1 菌种 污水中的大肠菌群。 3.2 培养基 乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基。 3.3 器材 4根接种环、干燥器、冰箱、4个250mL锥形瓶、3支产气管、17支试管、6套培养皿、14支无菌移液管(12支1mL管，2支10mL管)、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 3.4 试剂 革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、革兰氏四（蕃红）、医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 3 实验材料和器材 注： 1 乳糖胆盐液体培养基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和胆盐组成，属液态、鉴别、增值、半合成培养液，实验中用于废水中菌群的培养； 2 伊红美蓝琼脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氢二钾、伊红-美蓝和琼脂。琼脂平板用于分离纯化肠道致病菌，特别是大肠菌群和粪大肠菌群； 3 营养琼脂培养基：含牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和琼脂。用于分离纯化后的菌体培养。 4 实验方法和步骤 4.1 实验安排 4.1.1 实验准备 4.1.2 采样、恒温培养富集及初筛； 4.1.3 观察产气情况及稀释、倒培养基、划线、涂布、倒置培养； 4.1.4 鉴定、接种； 4.1.5 菌种保藏。 4.2 具体操作步骤 4.2.1 实验准备 4.2.1.1 配置培养基(伊红美兰琼脂培养基：7.4g+200mL无菌水、调pH7.2~7.4，营养琼脂培养基：6.6g+200mL无菌水、调pH7.4±0.2,0.85%生理盐水、乳糖胆盐液体培养基2.6g+100mL无菌水，调pH7.4±0.2),，装瓶，高压蒸汽灭菌。 4.2.1.2 包扎好培养皿，移液管，试管，进行干热灭菌。 4.2.1.3 将配好的乳糖胆盐液体培养基分装入三个试管中，每个大约十毫升，包扎，灭菌。 4.2.1.4 液体石蜡和涂布棒等其他实验玻璃器进行灭菌。 4.2.2 采样、培养 取水，湖水，废水三样约2~3滴于3支已灭菌的乳糖胆盐液体培养基试管中，贴好标签（采样时间、人物、温度，采样地点及天气情况），塞好棉塞，于恒温箱（37℃）培养18~24小时