CN106977591-CN201710308472-一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 106977591 A (43)申请公布日 2017.07.25 (21)申请号 201710308472.7 (22)申请日 2017.05.04 (71)申请人 广州康盛生物科技有限公司 地址 510530 广东省广州市广州高新技术 产业开发区科学城神舟街8号 (72)发明人 张海珍　余波光　李乐军　谢江明　 陈校园　 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 蒋欢妹　刘明星 (51)Int.Cl. C07K 14/31(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/34(2006.01) 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (54)发明名称 一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法 (57)摘要 本发明公开了一种分离纯化重组葡萄球菌 蛋白A的方法，采用两种混合机制的填料，两步层 析及超滤的方式有效地去除了内毒素、大肠杆菌 菌体残留蛋白(HCP)、大肠杆菌残留DNA、蛋白质 聚集体等一系列杂质，采用最少的步骤，获得最 纯的目标样品，节省了工艺控制成本，同时具有 稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化工业 化生产等特点。经纯化后的蛋白溶液，用高效液 相及SDS电泳测得蛋白纯度大于97％；蛋白 回收率大于75％；内毒素降低至1EU/mg以下；HCP 及大肠杆菌残留DNA均低于5ppm，可作为原材料 用于合成临床用葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。 A 1 9 5 7 7 9 6 0 1 N C CN 106977591 A 权　利　要　求　书 1/1页 1.一种分离纯化重组葡萄球菌蛋白A的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： 1)菌体预处理：将含有葡萄球菌蛋白A的菌体加入到Bis-tris缓冲液，然后用均质机破 碎后离心收集上清液，调节pH至2.0-4.0，离心收集上清液，然后调节pH至6.5-7.2，得到蛋 白液； 2)第一层析柱处理：将步骤1)得到的蛋白液上样至已用平衡液平衡的装有耐盐型阴离 子交换填料的层析柱中，继续用平衡液平衡，用冲洗液冲洗，最后用洗脱液洗脱葡萄球菌蛋 白A，收集洗脱峰得第一收集液；所述平衡液含10-30mM Bis-tris、0.5-2wt％TritonX-100、 0.1mol/L NaCl，pH6.5-7.2；所述冲洗液含10-30mM Bis-tris、0.1mol/LNaCl，pH 6.5-7.2； 所述洗脱液含10-30mM Bis-tris、1mol/L NaCl，pH 6.5-7.2； 3)超滤置换缓冲液：将步骤2)得到的第一收集液用截流分子量为5KD的超滤膜包超滤 置换为pH 6.8-7.5，含5-20mM的Na HPO -NaH PO 及0.1-0.3M脯氨酸的缓冲液，由此得到蛋 2 4 2 4 白液； 4)第二层析柱处理：将步骤3)得到的蛋白溶液上样至已用平衡液平衡的装有羟基磷灰 石层析填料的柱子中，继续用平衡液平衡，然后用洗脱液洗脱，收集洗脱峰得第二收集液； 所述平衡液含5-20mM的Na HPO -NaH PO 及0.1-0.3M脯氨酸，pH 6.8-7.5；所述洗脱液含 2 4 2 4 100mM Na HPO -NaHPO ，p