(精选)【医学课件】 流式细胞仪分析技术及应用教学课件.pptVIP

由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。 （一）单参数直方图 单参数直方图 细胞相对数量 信道(channel ) 1.双参数直方图点图 绿色荧光强度 红色荧光强度 双参数直方图点图 多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。 （四）流式细胞仪的多参数分析 Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。 三、设门分析技术 A 淋巴细胞 B 单核细胞 C 中性粒细胞 A、B、C均为任意门 线性门 第十七章 流式细胞仪分析技术及应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 流式细胞仪常检测的细胞特性 采用激光作为激发光源， 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析， 一、工作原理 （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统 1.流式细胞仪的基本结构： 由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 （1）液流系统 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 Flow Tip Laser SS and FL Detector FS Detector 光学系统示意图 主要由计算机及其软件组成 （3）数据处理系统 基本工作原理 单细胞液柱 已标记的单细胞悬液和鞘液 硅化管 流动室 喷嘴 荧光检测系统和 散射光感受系统 收集光信号 荧光染料被激发发光 光电倍增管 脉冲信号 计算机系统分析结果 放大 垂直相交 形成稳态 水平激光与之 基本过程 流式细胞仪与显微镜的区别 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。 二、散射光的测定 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 FALS Sensor Laser 前向散射光示意图 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。 FALS Sensor 90LS Sensor Laser 侧向散射光示意图 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 淋巴细胞 单核细胞 中性粒细胞 光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群 荧光染料的特性 激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION) 荧光补偿 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。 四、细胞分选原理 细胞悬液形成液流柱 流动室振动 液流断裂成液滴 空白液滴 含细胞的液滴 弃去 偏转落入收集器 压电晶体 产生机械振动 不充电 充电 （一）分选基本原理 参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 第二节 数据的显示与分析 FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少 一、 参数 单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析 直分析方图 设门分析:REGION和GATE设置 二、数据显示方式