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南京农业大学 生命科学学院 分 子 生 物 学 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 2 第五章 分子生物学研究法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术 2018-3-17 2 南京农业大学 生命科学学院 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 3 第五章 分子生物学研究法（上） 2018-3-17 3 南京农业大学 生命科学学院 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 4 第五章 分子生物学研究法（上） 2018-3-17 4 南京农业大学 生命科学学院 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 8 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 8 1965  S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定； 科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。 1966  M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。 1978  首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠； A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 9 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 9 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素； Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。 1983  获得第一例转基因植物。 1984  斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。 1986  GMO首次在环境中释放。 1988  J. D. Watson出任人类基因组计划首席科学家。 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse。 1992  欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。 2000 完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。 2001 完成第一个人类基因组全序列测定。 2004 中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。 2005 中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 10 第一节 重组DNA技术回顾 重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。 限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。 早在1967年，世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。 2018-3-17 10 南京农业大学 生命科学学院 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 11 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端 2018-3-17 南京农业大学 生命科学学院 12 DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a. DNA的粘性末端；b. DNA的平末端； c. 化学合成的具有EcoRI粘