(精编)【医学课件】 ELISPOT技术在乙型肝炎病毒(HBV)感染研究中的应用教学课件.pptVIP

ELISPOT技术在乙型肝炎病毒（HBV）感染研究中的应用 首都医科大学附属北京佑安医院 闫惠平 研究员，博士生导师 Margolis HS et al. Semin Liver Dis 1991; 11: 84–92. 乙肝病毒携带者流行分布 (3.6亿慢性乙肝病毒携带者): 2% – 低流行区 2–7% – 中度流行区 8% – 高流行区 乙肝病毒携带者的流行分布 HBsAg流行率在中国的地区分布 江西 山西 重庆 HBsAg流行率 黑龙江 吉林 辽宁 内蒙古 北京 天津 河北 山东 江苏 上海 浙江 台湾 福建 广东 海南 广西 云南 贵州 四川 西藏 新疆 青海 甘肃 宁夏 陕西 河南 湖北 湖南 安徽 1992年全国病毒性肝炎血清流行病学调查 8% 高流行区 2%~7% 中度流行区 HBV 携带者全球性分布 HBs Ag 携带者的分布 1% 1-10% 10% 少见 HCC 每年发病率 每 100,000 人 1-3 3-10 10-150 少见 HBV 携带者地理分布与肝细胞癌(HCC)发病率 ELISPOT---细胞免疫学技术 从单细胞水平检测分泌抗体的细胞或分泌细胞因子的细胞, 从单细胞水平评价机体的细胞免疫或体液免疫功能 不仅适用于特异性T细胞应答的检测 也可用于特异性B细胞应答的分析 ELISPOT技术的应用 疫苗研究 HBV疫苗：疫苗的免疫原性；疫苗的治疗效果；疫苗的给药途径；不同病人的敏感性 肿瘤疫苗：抗肿瘤甲胎蛋白和热休克蛋白DNA疫苗；肝癌疫苗； 抗原表位筛选： 丙肝CTL表位；用肽库筛选T细胞表肽；自身免疫病研究、诊断 器官移植 肝移植 ：肝移植免疫耐受; ELISPOT--在HBV细胞免疫中的应用 抗原表位肽的筛选,某些肽段有保护作用? 感染后细胞免疫功能的检测,判断乙肝病人在病程中所处的免疫状态（急性期、平稳期、耐受期、恢复期）,是否具有清除病毒的能力? 抗病毒治疗疗效监测,有无应答?停药后是否会反跳等; 器官移植后排斥反应的预测。 --------但是目前能够清楚说明临床问题的报道很少 乙 肝 病 毒 HBV的感染及复制过程 HBV cccDNA 每个感染肝细胞核中含30~40cps， 形成稳定的 cccDNA 池 (Minichromosome) 当前尚无任何药物能直接作用于cccDNA 抑制HBV复制的药物即使长期应用很难 清除 cccDNA Blackberg J et al. J Hepatology 2000; 33(6):992 Komori M et al. J Hepatology 2001; 35(6):798 Lewin S et al. Antiviral Research 2002; 55:381 佑安医院初步研究 研究目的 通过观察乙型肝炎病毒（HBV）特异性多肽刺激外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN-γ的能力，分析慢性乙型肝炎患者、慢性乙型重型肝炎患者及隐性感染者体内特异性T细胞免疫应答的差异和作用。 材料和方法 病例分组 慢性乙型肝炎组（CHB）20例 慢性乙型重型肝炎组（CSH）10例 正常对照组1（N1，隐性HBV感染者）6例 正常对照组2（N2，正常献血员） 10例 研究方法 合成四条HLA-A2限制的HBV特异CTL抗原表位肽作为刺激抗原。 表面抗原蛋白Te28-39（简称Te1） 表面抗原蛋白Te183-191（简称Te2） 多聚酶蛋白Tp573-581（简称Tp） 核心抗原蛋白Tc18-27（简称Tc） 采用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术检测抗原表位特异性T细胞的免疫应答功能。 结果1：HLA-A2基因表型检测结果 HLA-A2基因表型检测结果（流式细胞技术直接免疫荧光法） 左图为HLA-A2阴性结果，右图为HLA-A2阳性结果 结果2：抗原特异性CTL应答功能检测结果及分析 ELISPOT实验结果图 抗原特异性CTL对肽的反应结果 只要对任何一条肽刺激产生IFN-γ的阳性斑点者即计为反应阳性者。 CHB组，阳性率为50%（10/20） CSH组，阳性率为10%（1/10） N1组， 阳性率为83.3%