酶工程-05-酶分子修饰-2012-1.pptVIP

酶 工 程Enzyme Engineering 第 五 课 酶 分 子 修 饰 Modification of Enzyme Molecules 酶 分 子 修 饰 什么是酶分子修饰 酶分子修饰（enzyme molecular modification） 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程 酶分子工程（enzyme molecular engineering） 指按照酶的各种特性的需要，依据结构－性能间的关系，在分子水平上实现酶的结构设计和操作 分子生物学水平：用基因工程方法对 DNA 或 RNA 进行分子改造，以获得化学结构更合理的酶蛋白 一级结构水平：对天然的酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等 酶 分 子 修 饰 对酶进行分子修饰的原因和依据 在非生理条件下，酶的某些性质不满足工程应用 生理最适温度、pH 值 ≠ 体外最适温度、pH 值 酶分子对热、酸、碱、有机溶剂的耐受性较差 酶在非生理条件下活力下降，抗原性显著 理论依据和方法 酶的结构特点与酶催化特性的关系：构效关系 理性设计（rational design）：找出关键结构，在掌握酶的构效关系的基础上，有目的地对其进行改造 半理性设计（semi-rational design）：以基因的随机重组为手段，参考酶的构效关系进行关键位点的改造 酶 分 子 修 饰 酶分子修饰的意义：我们究竟要做什么？ 应用角度 —— 酶工程 提高酶的催化效率，改变底物专一性 增强酶的稳定性，降低 / 消除酶的抗原性 研究角度 —— 酶学 研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探索酶的结构与催化特性之间的关系 探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程 酶 分 子 修 饰 酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维持酶活性功能的必需基团 pH 值与离子强度 决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态 修饰反应的温度与时间 严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应 反应体系中酶与修饰剂的比例 控制二者的比例，防止酶的过度修饰而导致的活性完全丧失 酶 分 子 修 饰 酶 分 子 修 饰 化学修饰的方法学 酶 分 子 修 饰 化学修饰的方法学 酶 分 子 修 饰 酶分子修饰的种类 金属离子置换修饰（重点） 大分子结合修饰（重点） 侧链基团修饰（重点） 亲和修饰 肽链有限水解修饰（重点） 核苷酸链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 酶分子的物理修饰 酶的定向进化修饰 酶 分 子 修 饰 金属离子置换修饰 Metal ion substitute modification 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的催化特性发生改变的修饰方法 通过修饰了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，阐明催化机制 适用对象：金属酶（metalloenzyme） 一种结合金属的酶，以一个或几个金属离子作为 辅因子 金属离子或是直接参与催化作用，或是对保持酶的活性和构象起稳定作用 金属酶纯化时仍保留着定量 的功能金属离子 酶 分 子 修 饰 金属离子置换修饰 常见的金属酶及其离子种类 ?-淀粉酶 —— Ca2+、Mg2+、Zn2+ 谷氨酸脱氢酶 —— Zn2+ 过氧化氢酶 —— Fe2+ 酰基氨基酸酶 —— Zn2+ 超氧化物歧化酶 —— Cu2+、Zn2+ 细胞色素 P450 单加氧酶 —— Fe2+ 固氮酶 —— Fe(II)、Mo(IV) 谷胱甘肽过氧化物酶 —— Se(IV) 主要的金属离子 Ca、Mg、Cu、Zn、Co、Fe、Mn 等 酶 分 子 修 饰 金属离子置换修饰 金属离子置换修饰的方法 酶的提纯 除去原有金属离子 加入金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物 透析、超滤或层析除去螯合物 加入置换的离子 加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合 用透析或层析等方法除去未结合的离子 酶 分 子 修 饰 金属离子置换修饰 金属离子置换修饰的作用 阐明金属离子对酶催化作用的影响 一般在活性中心的金属离子能与底物或辅酶 / 辅基可逆结合，从而起到催化作用 提高酶的催化效率 将 Zn 型?-淀粉酶置换成 Ca 型，活力可提高 20%～30% 增强酶的稳定性 Fe-SOD 置换成 Mn-SOD 后稳定性增强，对 NaN3 敏感性降低 改变酶的动力学特性 酰化氨基酸水解酶活性部位的 Zn 被 Co 置换后，酶的底物专一性（