(食品酶学)5酶的固定化技术.ppt

第五章酶的固定化技术 生物与食品工程学院·食品酶学 为什么要将酶固定化？ 游离酶在应用中的不足 稳定性较差； 难于回收重复利用； 给后续分离纯化增加困难。 固定化酶 定义：固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。 优点：稳定性增加；可反复使用；利于连续操作；易于和反应产物分离。 酶的固定化技术的发展 1953年，Grubhofer和Schleith首先开始了酶固定化研究，并首次制成了固定化酶。 1969年，千烟一郎成功应用固定化氨基酰化酶连续生产L-氨基酸，首次实现了固定化酶的工业化应用。 1971年，第一次国际酶工程学术会议上，确定了固定化酶的统一英文名称immobilized enzyme。 1973年，千烟一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆菌菌体（死细胞），并实现了L-天冬氨酸连续生产。 酶的固定化技术的发展 1976年，法国首次用固定化酵母细胞（活细胞）生产啤酒和酒精，实现了活细胞的固定化。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展，实现了原生质体的固定化。 · · · 本章内容提要 5.1 酶的固定化 酶的固定化方法 固定化酶的性质 固定化酶的应用 一、酶的固定化方法 通常采用的固定化方法可大体概括为：吸附法、共价结合法、交联法、包埋法和热处理法等。 一、酶的固定化方法 1、吸附法 定义：通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 根据吸附剂的特点又分为两种： 物理吸附 离子交换吸附 物理吸附法 定义：通过氢键、疏水键等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。 常用的载体 无机吸附剂：活性炭、高岭土、氧化铝、硅胶、微孔玻璃、多孔陶瓷等； 有机吸附剂：纤维素、火棉胶等。 通常有机吸附剂的吸附容量高于无机吸附剂；有机吸附剂可能使酶发生吸附变性。 离子交换吸附法 定义：在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的离子键作用而达到酶固定化的方法。 常用离子交换剂：CMC、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。 一、酶的固定化方法 1、吸附法 定义：通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 根据吸附剂的特点又分为两种： 物理吸附 离子交换吸附 特点： 优点：操作简便，条件温和，吸附剂可反复使用。 缺点：酶和载体吸附力较弱，易解吸脱落。 一、酶的固定化方法 2、共价结合法 定义：借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联制备固定化酶的方法。 常用载体： 天然高分子及其衍生物：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质等； 合成高聚物：聚丙烯酰胺、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。 一、酶的固定化方法 2、共价结合法 偶联成功与否取决于： 载体中功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。 酶分子中侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪唑基。 载体首先需活化，即引入活泼基团。活化方法有： 重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等。 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引入活泼的重氮基团。而后与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应制得固定化酶。 含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。而后与酶分子中的氨基、羟基和疏基等反应而制成固定化酶。 含有羟基的载体，可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物，而后可在微碱性的条件下与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶 含羟基的载体可用三氯-均三嗪等多卤代物进行活化，然后与酶分子上的氨基、巯基、羟基发生烷基化反应，制备固定化酶 一、酶的固定化方法 2、共价结合法 特点： 优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。 一、酶的固定化方法 3、交联法 定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交联反应，制备固定化酶的方法。 常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等双功能试剂。 特点： 优点：操作简便，结合牢固，可长时间使用。 缺点：交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，且制成的固定化酶颗粒较小，机械强度也较低。 一、酶的固定化方法 3、交联法 此法与共价偶联法利用的均是共价键，不同之处：交联法不使用载体 双重固定化 可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。 例如：将酶先用凝胶包埋后再用戊二醛交联，或先将酶用硅胶等吸附后再进行交联等。 一、酶的固定化方法 4、包埋法 定义：将酶包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。 常用载体：琼脂、海藻酸钠、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等。 根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为 凝胶包埋法 半透膜（微胶囊）包埋法 一、酶的固定化方法 4、包