In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes讲解材料.ppt

新生鼠睾丸功能性精子的体外培养;小组成员;小资料;小资料;摘要;前言;精子的产生;检测方法;组织培养方法;ＦＢＳ(胎牛血清液体培养基)和血清替换对于小鼠睾丸组织的影响 ;; ;;;KSR (激酶抑制剂 Kinase Suppressor Of Ras)对新生睾丸组织的影响;10% KSR能分别诱导出生2.5天和0.5天小鼠睾丸组织细胞中的Acr-GFP和Gsg2-GFP的基因表达;;完成 Gsg2-GFP的表达的细胞取自于被培养了21天的出生2.5天的小老鼠睾丸组织,与抗体结合对抗GFP和AR，并被赫斯特染剂染色。;问题;培养基的改善;培养条件的细化;检查蛋白质SYCP1 ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;设计实验提取培养组织中的单倍体细胞 (因为精细胞是单倍体);减数第一次分裂;在培养了27到 45天的 Acr-GFD小老鼠睾丸组织样品中发现大约5/11的精子有尾巴 （注释：精子在进行受精作用时，要依靠尾巴的摆动力量）。如图;a 、将 Acr-GFP新生小鼠睾丸组织培养27天后，在这种睾丸的分离组织细胞中发现了GFP阳性顶体（顶体是覆盖于精子细胞核前面的扁囊状结构，是一种特化的溶酶体，内含多种与受精作用有关的酶），说明这里的精子生长能进行到精子发生的第六步, 插图表示的被赫斯特染上色的Acr-GFP精子细胞 b、 在相同的样品中，观察到有尾巴的细胞。 c、带有Acr-GFP顶体的精子被赫斯特（注释：是一种荧光色素，用于DNA、染色体和核酸的染色，为蓝色）染上了颜色。 d、把出生1.5天的Gsg2-GFP老鼠的睾丸组织细胞培养35天后，注入到流式细胞仪中（这里流式细胞仪的作用是依靠激光器照射细胞所携带的不同荧光物质产生的不同荧光进行检测某种细胞含量）。结果发现用KSR培养的组织细胞中有单倍体细胞(箭状物,全部细胞的1.71%） e、成年老鼠睾丸组织细胞培养作为对照实验 f、将刚出生2.5天的Gsg2-GFP老鼠的薄片组织培养38天，精小管中有精子产生且 发育良好。 P3 ; 用流式细胞仪来分析出的含有单倍体、二倍体、四倍体的培养组织细胞分析结果如下图。说明1N代表的是单倍体细胞，在这个实验中也就是指精子。 ;在每个组织块的周边地区,由于精细胞尾巴的形成,精子的位置能容易地地被观察到(如图)。;  1、 在一些组织细胞扩增实验中,随着小??鼠睾丸组织细胞体外培养天数的增加， Gsg2-GFP表达情况发生变化。实验数据显示组织培养在30天到40天内，Gsg2-GFP表达水平都保持在最高程度,而后随着出生日数的增加，Gsg2-GFP表达水平逐渐下降,直到70天以后，Gsg2-GFP表达水平保持不变。;体外培养的精细胞和精子的生育能力测试;分别用ROSI和ICSI方法获得7个和5个活的后代; 对12个后代用PCR分析鉴定出有4个的尾部尖端DNA携带GFP，同时存在培养的睾丸组织中有杂合的Gsg2-GFP 。; 通过后代雌雄交配，对他们的生殖能力进行了检查，结果显示所有4只雄鼠和8只雌鼠都有生育能力。 ; 我们认为如果可行的话，低温贮藏睾丸组织可以将我们的研究结果扩大到各种实际应用中。因此，我们冻结了新生幼鼠的睾丸组织，并将它们放置在液氮中4-25天。解冻后，他们以和非冷冻样品相同的方式生长在琼脂糖中。在所有四个实验中使用的Acr-GFP小鼠，并在两个实验中使用Gsg2-GFP小鼠观察GFP的表达。在Gsg2-GFP表达组织的组织学检查中，可在审查的五个组织中的一个观察到细长的精细胞。这些结果表明，睾丸组织碎片可在体外冷冻保存并且全面恢复生精功能。; KSR是本实验成功的关键，阐明其作用机制 和识别关键因素对我们进一步细化培养条件有重要 作用。我们已经测试了几个被报道包含在KSR22的 因素，并发现脂质丰富的牛血清白蛋白(FBS)可能是 关于我们现在研究结果最重要的组成部分。因为 AlbuMAX的添加替代KSR产生了几乎相同的结果（补充图11，丙）。此外，FBS似乎不包含抑制精子形成过程的因素，因为（中间的）同时包含FBS和诱导精子形成的效果和只包含AlbuMAX的一样（补充图11 b）。此外，进一步研究以确定KSR和AlbuMAX的关键分子，是必要的。 ;利用新生小鼠睾丸在试管外培养具有功能性的精子 (步骤);;2、组织培养所用的介质和试剂 培养的介质有： (a-MEM)、(RPMI)、（DMEM）、 (Ham) 等。 下面的一些因子也要加入介质中：肝细胞生长因子 （5ng/ml）、激活素A（100ng/ml）、从人体中提 取的促卵细胞激素（200ng/ml）、睾酮（1微摩）、 重组人骨形态发生蛋白4（20ng