双相蛋白电泳.DOC

双相蛋白电泳 双向电泳IEF (sigma) IEF（not IPG）/SDS最简单的装备推荐如下，适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的，嘻嘻！ IEF用Biorad的圆盘电泳槽（不行用国产的吧，不推荐），SDS用六一厂的就可以了（ft，六一厂应该给我money吧，给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的，买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧，呵呵） BIO－RAD 的圆盘电泳槽，国产的不推荐，因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点，不是很进去，而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈，影响电聚焦。 双向电泳 蛋白质样品制备 秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等（1986）的方法进行。100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯 吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇），混匀，-20沉淀1 小时，4，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。 按每mg干粉加入20μl（可调） UKS液[9.5 M尿素，5mM 碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37育30min，期间搅动几次，28度 （温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存 2 蛋白质浓度测定 按Garrels（1983）的程序，稍加改动。10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸，冰浴30min后，4，4000 r/min离心15min，弃上清，再加入100μl冷丙酮，同上离心5min，弃上清，冻干沉淀，用100μl PBS溶液复溶，并按Bradford（1976）的程序测定蛋白质浓度。说实话，好象Bradford法不太好做 2.3.1 电聚焦（IEF） 2.3.1.1 玻管准备 干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部，在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上。电聚焦的管子，买原装的也可以，实在不行自己也可以做的，1ml 的移液管，内径1.5mm左右的，长度取18cm，用玻璃刀做，呵呵，很容易的；玻璃管的处理，先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr，用自来水冲后;用双蒸水冲，用双蒸水泡至少1hr，中间至少换2，3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时，用双蒸水冲，（不能用自来水冲），然后双蒸水泡至少1 个小时，中间换3，4 次水，可多泡一会。最后泡在无水乙醇里 面1hr，轰干就可以用了. 2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦 灌IEF的配方 为3.09克尿素 1.125 ml 10%NP-40 1.125ml 水 0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62) 0.15 ml Am 3.5-10 0.375ml Am 5-7 8卫生 10%AP 1.8卫生 TEMED 用注射器吸好胶液，装上7号针头，将7号针头插入玻管底部，边推注射器边提针头，直到标记处，用微量进样器小心加入少量水，可见明显的界面出现，让其聚合1小时以上，适当长一点的时间好一些，我一般是头天下午灌胶，第2 天下午才开始跑电泳。待胶聚合好后，除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液，加样80μg，上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面。即可进行电泳。电极液为：上槽（负极）为50m mol/L NaOH 液，下槽（正极）为25m mol/L H3PO4。按200V×15min，300V× 30min，400V×18h，1000V×1h的程序进行电聚焦。或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度 暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好. 2.3.1.3 电泳后的凝条处理 电聚焦完毕后，用注射器吸满水，套上一个200μl的枪头，当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气。从顶部向下注水使胶条向下滑出。当然，刚开始