[医药卫生]第五章分子荧光法.pptVIP

基本概念 某些物质的分子吸收能量后可发出光，根据发出的光的特性不同称为荧光和磷光。 分子荧光（磷光）分析法：根据分子荧光（磷光）的特征和强度对组分进行定性和定量分析的方法称为分子荧光（磷光）分析法。 常用的为分子荧光分析法。 基本概念 分子荧光分析法特点： 灵敏度高：最低捡出限为10-12g/L。 选择性好：能吸光的物质，不一定能发荧光；不同的物质吸收同一波长的光后发射的荧光不同。 但应用范围较窄。 第一节 基本原理 1、基本术语： 每个分子都具有一系列不同的电子能级 基态：能量最低的电子能级，室温下分子基本处于电子能级的基态。 激发态：能量较高的各个电子能级， 吸收能量后一个电子激发到高能态轨道上，若自旋方向不变，此状态称为单线激发态。若自旋方向改变，此状态称为三线激发态。 第一节 基本原理 1、基本术语： 去激发：激发态分子若通过无辐射跃迁（以热能形式放出能量）或者辐射跃迁回到基态，此过程称为去激发过程。 荧光或磷光：以光辐射跃迁形式散失能量，回到基态的各个能级，这时的光辐射为荧光或磷光。 分子吸收光能后从基态跃迁到激发到S1或S2的不同振动能级上，通过去活化过程，回到第一激发态S1的最低振动能级上。 处于第一电子单线激发态最低振动能级的分子返回到基态的不同振动能级上所发出的光称为荧光。 分子吸光后从基态跃迁到激发到S1或S2的不同振动能级上，通过去活化过程，回到第一激发态的三重态T的最低振动能级上。返回到基态的不同振动能级上所发出的光称为磷光。 单重态与三重态 激发态→基态的能量传递途径 非辐射能量传递过程 辐射能量传递过程 荧光和磷光的主要区别 二、激发光谱与发射（荧光）光谱 1激发光谱 改变激发光波长λ激，测定溶液所发出的某一固定荧光波长的强度F，绘制 F-λ激曲线，此曲线称为激发光谱。 2、荧光光谱 改变荧光波长λ荧，测定在固定激发光照射下溶液所发出的荧光的强度F，绘制 F-λ荧曲线，此曲线称为荧光光谱。根据荧光光谱可找出合适的荧光测量波长。 硫酸奎宁的激发光谱及荧光光谱 3、荧光光谱与激发光谱的关系 （1）荧光发射波长总是大于激发光波长 （2）荧光光谱与激发光波长无关，荧光强度则与激发光波长有关。 （3）荧光光谱与激发光谱呈镜像对称关系。 镜像规则的解释 镜像规则的解释 三、 分子结构与荧光的关系 1、物质产生荧光的必备条件 物质分子必须具有强的紫外-可见吸收的特征结构； 必须具有较大的荧光效率： 三、 分子结构与荧光的关系 荧光效率 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射； 2、分子结构与荧光 （1）温度：低温荧光效率高，尽量采用低温。 （2）溶剂：溶剂的极性增强，荧光增强。 （3）pH值： pH值影响物质的存在形式，从而影响荧光效率。 （4）散射光的影响：物质分子和其它分子改变激发光的方向称为散射光。又分为瑞利散射和拉曼散射。散射光对激发光和荧光都会产生干扰。 （5）荧光熄灭剂的影响：卤素离子、重金属离子、氧分子等使荧光减弱，应避免。 （6）表面活性剂的影响：表面活性剂可提高荧光效率。 （7）激发光 ：绘制激发光谱找出合适的激发光。光照时间不要太长，避免荧光物质分解。 第二节 荧光分析仪器 一、主要部件 测量荧光的仪器称为荧光分光光度计。其基本结构分为五个部分：激发光源、样品池、单色器、检测器、显示器。结构如图所示： 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角 第二节 测量荧光的仪器 荧光分析仪器类型 荧光光度计 荧光分光光度计 第三节 定性和定量分析 一、定性分析 二、定量分析方法 1、标准曲线法：测出标准系列的荧光强度Fs，样品的 Fx及样品空白的F0，绘制(Fs- F0)—cs曲线，求出Fx- F0所对应的cx。 2、直接比较法：标准溶液cs、 样品cx、空白同样操作，测出Fs、 Fx、 F0。 第四节 荧光新技术和应用示例 时间分辨荧光分析： 三维荧光分析： 核酸分子荧光探针 薄层扫描法中的荧光扫描法 总结 1、什么是荧光，荧光产生的基本原理。 2、什么是激发光谱和荧光光谱（发射光谱的概念）； 3、物质产生荧光的条件，什么是荧光效率； 4、荧光定量分析的依据，以及定量分析的方法。 5、荧光分析仪器的主要组成部件，各部件的作用；与紫外分析仪器的主要区别。 光源：氙灯，卤钨灯，高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区) 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；