蛋白质工程在医药工业中的应用幻灯片.ppt

抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。 PCR技术; 免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达; 噬菌体表面展示文库技术。 5 抗体库技术 初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。 它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。 噬菌体抗体库技术 1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基因的筛选工作带来了革命性的变革。 噬菌体表面展示系统(phage surface display system ) 噬菌体表面展示文库技术的要点: 外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端 将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或g8 的先导系列的紧靠下游 随机克隆入相应载体形成组合文库 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段 用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 蛋白质工程的应用 第一节　抗体工程 抗体(antibody)是抗原刺激人或动物机体的免疫系统后，由B淋巴细胞转化为浆细胞产生的、能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。 抗体可与细菌、病毒或毒素等抗原结合，并通过特定的方式清除异物。 第一节　抗体工程 抗体工程(antibody engineering)是通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体蛋白序列进行改造，改善抗体某些功能的技术。 抗体的分类 根据抗体的制备方法和技术，将抗体分为多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三类。 抗体的分类 多克隆抗体：传统的抗体制备的方法是将天然抗原经过各种途径免疫动物，因为抗原性物质具有多种抗原决定簇，所以刺激机体产生了多种B细胞克隆针对不同抗原决定簇产生的混合抗体，并合成和分泌各抗体到血清和体液中，这种用体内免疫法所获得的免疫血清。 单克隆抗体 当抗原进入体内，在机体中就会诱导出针对不同抗原决定簇的多种抗体，如果要把这些抗体一一分开，用现有的生物化学或物理化学方法是根本办不到的。1975年科勒和米尔斯坦将小鼠免疫细胞与肿瘤细胞融合，培养出既能迅速生长繁殖又可分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。从而获得针对某一特殊抗原决定簇的单克隆抗体。 * 南京农业大学 生命科学学院 抗体的分类 单克隆抗体：同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质、分子结构、遗传标记及生物学特性等方面都完全相同的均一性抗体。 1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 构建重组表达载体 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。 人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相