模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定.pptVIP

十三 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定 一、实验目的： 1. 学习用PCR方法检测生物遗传差异； 2. 了解植物T-DNA插入突变体的鉴定原理。 二、实验原理 1. Ti质粒和T-DNA Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。人们根据这一现象，将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。 2. T-DNA插入基因内部导致基因突变 T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。 3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体，LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。 左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP： TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp 三、实验步骤 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分离群体30个株号的植株。 实验方法：（每人做1个株号的检测） (一) 拟南芥基因组DNA提取 1. 原理 分离动物、植物、微生物DNA是进行遗传操作（基因组DNA序列分析、遗传标记分析、基因克隆、基因定位）的第一个步骤。不同的研究目的对DNA的纯度和产量要求不同。 如：构建基因文库及用于限制性片断长度多态(RFLP)等对纯度要求高； 用于PCR分析的DNA则应不含干扰PCR反应的污染物； 用于遗传标记分析的DNA，纯度要求低但产量则要高。 一个好的分离程序应符合三个标准： ①所得DNA的纯度满足下游操作要求； ②所得DNA应完整； ③所得DNA量足够。 DNA在化学上是稳定的，但它在物理上是易碎的，高分子质量的DNA长而弯曲，即具有极微弱的侧向稳定性，易受到最柔和的流体剪切力的伤害，由吸液、振荡、搅拌所致的水流能剪切断DNA双链。 提取动物、植物、微生物基因组的DNA所面临的问题不尽相同，在这个实验中学习植物总DNA提取与鉴定。 本实验采用CTAB法。 CTAB的主要作用是破膜。 CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。 酚/氯仿/异戊醇的作用是去除核酸制品中的蛋白质，并有利于水相与有机相的分开，而且可以消除泡沫。 异丙醇或乙醇的作用是脱去DNA周围水分子，使DNA失水而聚合沉淀。 2、药品 CTAB提取液（1000 ml）组成： 20 g CTAB 100 ml 1 M Tris-HCl pH 8.0 40 ml 0.5 M EDTA pH 8.0 81.8 g NaCl 0.2%(V/V)β-巯基乙醇 注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇 酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1 氯仿/异戊醇： 24：1 TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L 3 M NaAc（pH 5.2） 3. DNA提取步骤 用