蛋白质研究技术-华中农业大学.PDFVIP

第二章 蛋白质研究技术 第一节 蛋白质的分离纯化 第二节 蛋白质的鉴定 第三节 蛋白质的检测 第四节 蛋白质的结构分析 第一节 蛋白质的分离与纯化 一、蛋白质分离纯化的基本原则 二、蛋白质分离纯化的方法 一、蛋白质分离纯化的基本原则 1、选择丰度高、便于提前的材料 2 、了解目的蛋白质的稳定性 3 、探索有效的抽提法和浓缩法 4、建立一套层析的组合 5、以较好的方法贮存 贮存 一、蛋白质分离纯化的方法 粗提： ①盐析 ③有机溶剂沉淀 ②结晶 ④等电点沉淀 精提 ： ① 离心（centrifugation ） ② 电泳（electrophoresis ） ③ 层析（chromatography ） ①离心（centrifugation ） 原理：悬液中的各种粒子（细胞，细胞器及分子） 有不同的质量（mass ）或密度（density ），因此在离 场中有不同沉降速率。 不同的蛋白质分子量差别很大，但密度差别很小。 蛋白质的平均密度是1.37 g/cm3 。除非蛋白质结合 了脂或碳水化合物，蛋白质之间密度的差异不会超 过15%。 离心力由转子中心到蛋白质界面的距离来决定。 离心（centrifugation ） 沉降系数（sedimentation constant ）：每单位离 心场的速度（S ）。与蛋白质的密度和形状有关， 也与介质的密度和粘度有关。 离心可用于两个方面： 作为分离技术：从混合物中分离一种成分； 作为分析技术：测定物质的物理性质，如分子 量，密度，形状及平衡结合常数（equilibrium binding constants ）。 离心（centrifugation ） Ⅰ. 差速离心（differential centrifugation ） Ⅱ. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation ） Ⅰ. 差速离心（differential centrifugation ） 从组织匀浆中把可溶性 的蛋白质与细胞的不溶 性成分分开。 离心后，蛋白质留在上清 液（supernatant ）中， 其他成分形成沉淀 （pellet ） 差速离心（differential centrifugation ） 采用不同的 速度和时间 可以分离不 同的细胞结 构 速度 时间 Ⅱ. 速率区带离心（rate-zonal centrifugation ） 用蔗糖、甘油或氯化铯形成密度 度； 高速离心机（~ 40,000 r/min ）； 离心后，被分离的物质分布在相 的密度区带内； 注意：控制时间。太短，达不到 充分分离；太长，分离物沉淀到 心管底部。 速率区带离心（rate-zonal centrifugation ） 不能精确测定分子量，因为蛋 白质的形状差异也影响沉降率； 一次分离多种不同类型聚合物 或颗粒的最有效方法 平衡密度梯度离心（equilibrium density-gradient entrifugation ）： 用于分离DNA 和细胞器 ② 电泳 （electrophoresis ） 带电颗粒在电场中的移动的速度，由电荷– 质量 比决定。 电泳（electrophoresis ） Ⅰ. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） Ⅱ. 等电聚焦（isoelectric focusing