western 蛋白印记实验方法.pptVIP

一 Western Blot 1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。 2 操作过程 SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 Hours 0 4 8 16 ? Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3. IM9/Bcl-2 Cells were treated with 20?M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control ? 0h 4h 8h 16h ? Western Blot analysis of cytochrome C release. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol in gossypol-treated IM-9/Bcl-2 cells. Cells were treated with 10μM gossypol for different times, cytosol and mitochondrial protein were subject to SDSfollowed by immunoblot with cytochrome c specific antibody. Cyto-C X-Protein 3 注意的问题 （1） 蛋白质电泳 常用SDS：单一亚基组成的蛋白质 非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质 Tris-Tricine胶中电泳：用于分子量小于10kDa的多肽和蛋白的电泳，能够获得较好的分离效果。 聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套 （2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min，如果是PVDF膜，必须先用甲醇激活后浸泡。 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：100V 1-2h,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，凝胶用考马氏亮兰染色以确定转移效率 膜用丽春红染色观察蛋白分子量标准的位置 （3）封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4oC过夜 （4）显色或显影 显色 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品） 注意：化学发光前将膜用不含Tween20的TBS或PBS洗涤一次 曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定 （5）膜的再利用 化学发光后的硝酸纤维素膜用Stripping Buffer洗涤后（洗涤Buffer: 62.5mm pH6.7 的Tris-HCI含2％SDS和100mm的? －2ME ） 用不同的一抗进行杂交，检测其它蛋白的表达情况。一张膜可以重复使用3－4次。 碱性磷酸酶显色的膜不能再进行杂交