中国药科大学生物制药工艺学课件 12制备型高效液相色谱.pptVIP

第十二章 制备型高效液相色谱 在生物制药中的应用 基因工程药物:白细胞介素、胰岛素。 天然产物: 蛋白质,多肽,多糖。 第一节 高效液相色谱法简介 液相色谱的发展史 1903年，色谱法问世俄国植物学家茨维特 1903年3月21日，大会报告 “一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用” 1906年在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法 1931年，库恩（Kuhn）分离胡萝卜素，1938年，Kuhn和Lederer从维生素B中分离出B6，获得了1938年的诺贝尔化学奖。 1941年，马丁（Martin）和辛格（Synge）提出液液分配色谱法，1952年度的诺贝尔奖。 60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的成功研制 1.2 基本仪器装置 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 三、高效液相色谱法的特点 采用高效色谱柱、高压输液设备和高灵敏度检测器, 从而实现了高效、高速、高灵敏度和定量准确。 和经典液相相比有以下优点：快速、灵敏度高、分辨率高、自动化程度高 等。 四、制备型高效液相色谱与分析型高效液相色谱法的区别 流速不同 检测池不同 上样量不同 色谱柱不同 五、色谱的基本理论及有关参数 两大理论： 塔板理论(the plate model):阐明了色谱、蒸馏和萃取之间的相似性，将色谱柱设想成由许多液液萃取单元或理论塔板组成；相似于精馏过程，色谱分离也是一个分配平衡过程 . N = 16 (tR / wb)2 N = 5.54 (tR / w1/2)2 速率理论:研究各种动力学因素对峰展宽的影响。 H= A+Cu 有关参数 分离度：在色谱过程中表示两组分相互分离的程度,一般情况下,分离度大于1.5时称分离完全. 只有峰窄而间距大的分离是令人满意的。 在色谱分析中要求： 两组分的保留值差别要足够大。 两色谱峰要足够窄。 待测组分的分离度要足够大，分离过程要尽可能短. 容量因子：溶质在固定相中的总摩尔数与流动相中总摩尔数之比。 选择因子：两组分容量因子的比值 容量因子、选择因子、理论塔板数对分离度的影响 六、制备型高效液相色谱的重要参数 Capacity:纯化过程中，目标物质的上样量。可以是体积也可以是质量。 Speed:在除去蛋白酶的过程中此项非常关键。 Recovery:产品贵重时此项很重要。流动相的条件、环境会影响它。减少步鄹和保持一种对生物样品合适的环境条件。 Resolution:在纯化的最后阶段，此项很关键，尤其是杂质的结构和目的物结构相似时。 七、分离机理和色谱类型 分离蛋白质类物质时的分离依据： 疏水性 分子大小 等电点 结构特异性 色谱介质按分离机理分为 正相色谱 反相色谱：常加入TFA 离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE二乙基氨基乙基，Q季胺盐）阳离子交换色谱（CM羧甲基S磺酸基） 凝胶过滤色谱 疏水色谱：苯基，辛基等。 金属螯合色谱：镍、铜等 亲合色谱 第二节 分离方案的设计 What is the intended use of the product? What kind of starting material is available and how should it be handled? What are the purity issues in relation to the source material and intended use of the final product? What has to be removed? What must be removed completely? What will be the final scale of puridication? What are the economical constraints and what resources and equipment are available? 一、分离方法之间的组合 四步纯化法： Preparation: Capture:(Isolate,concentrate and stabilize) Intermediate purification:(Remove bulk impurities) Polishing:(Achieve final high level purity) 色谱之间的组合方案 AC、GF、IEX、HIC 二、分离条件的优化 合适的溶剂强度:容量因子k’ 足够的柱效N: 良好的分离选择性α: 当柱过载时： 1 N和k’都随样品负荷的增加而迅速地减小 2 流速对于塔板数N的影响大大地降低 3 通过增加